亚硝酸盐与微囊藻毒素联合暴露通过PINK1介导的线粒体自噬诱导精原细胞损伤的机制研究

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Nitrite and microcystins co-exposure triggers PINK1-mediated mitophagy in spermatogonia

　　本研究针对水体富营养化环境中常见的亚硝酸盐(NaNO2)和微囊藻毒素-LR(MC-LR)联合暴露导致的雄性生殖毒性问题，通过体外小鼠精原细胞(GC-1)模型，揭示了PINK1介导的线粒体自噬在联合毒性中的核心作用。研究发现联合暴露可协同诱导mtROS升高、ΔΨm下降等线粒体损伤，并激活PINK1/Parkin通路促进线粒体自噬。利用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ干预可有效缓解上述损伤，为环境污染物生殖毒性的防治提供了新靶点和理论依据。

　　

在当今全球范围内，男性生殖健康正面临着严峻挑战，环境污染物暴露与精子质量下降的关联性日益受到关注。随着水体污染和富营养化问题的加剧，蓝藻水华频繁发生，释放出微囊藻毒素(MCs)这类有害物质。与此同时，作为藻类生长关键营养源的氨氮可转化为亚硝酸盐(NaNO₂)，直接危害人体健康。在富营养化水体中，亚硝酸盐浓度与微囊藻毒素含量通常呈正相关，这两种污染物经常共同存在，形成复合污染态势。

世界卫生组织(WHO)规定饮用水中MC-LR的安全浓度不得超过1μg/L，然而自然水体中的MC-LR浓度可能超过安全限值数百甚至数千倍。例如，非洲南部和南非共和国水域中的MC-LR浓度分别达到702μg/L和2803μg/L，而美国切萨皮克湾水域甚至高达6000μg/L。同样地，在严重水华影响区域，亚硝酸盐浓度可超过50mg/L，远高于WHO规定的3mg/L限值。这种现实情况使得研究两种污染物联合暴露的毒性效应具有重要的现实意义。

虽然已有研究表明MC-LR和亚硝酸盐单独暴露均可引起生殖系统损伤，但关于它们联合暴露对生殖系统的危害效应及机制尚不清楚。流行病学研究发现，暴露于MC-LR或亚硝酸盐与生殖系统疾病、精子质量下降和胎儿出生缺陷相关。MC-LR进入生殖细胞后可诱导线粒体损伤和内质网应激，导致睾丸细胞发生各种形式的程序性坏死。而亚硝酸盐的实验研究表明，它会损害大鼠睾丸生殖功能，导致血清睾酮水平、促卵泡激素(FSH)水平、精子数量和精子活力显著降低。

值得注意的是，关于亚硝酸盐和MCs对生殖系统的联合效应和影响的研究发现相对较少。已有研究报道，NaNO₂和MC-LR联合暴露会破坏斑马鱼下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴相关基因的表达，导致生殖内分泌紊乱。另有一系列证据表明，MC和亚硝酸盐联合暴露可通过抑制超氧化物歧化酶1(SOD1)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶的活性，破坏生殖细胞氧化抗氧化系统稳态，触发细胞氧化应激，这被认为是NaNO₂和MC-LR引起生殖毒性的重要因素。此外，NaNO₂和MC-LR联合暴露还可通过线粒体氧化损伤诱导精原细胞和支持细胞发生程序性死亡，并协同引起精子发生障碍。

线粒体作为细胞活性氧(ROS)产生的主要场所，也是NaNO₂和MC-LR诱导毒性的关键靶点。在三磷酸腺苷(ATP)合成过程中，线粒体产生大量ROS。过度的ROS积累可引发氧化应激，破坏线粒体稳态，损害细胞功能，可能导致细胞死亡。MitoQ是一种由辅酶Q10和三苯基膦(TPP+)组成的线粒体靶向抗氧化剂，具有清除ROS的能力。一个关键问题随之产生：MitoQ能否通过靶向并减轻线粒体ROS来缓解NaNO₂和MC-LR诱导的生殖细胞损伤？

线粒体功能的稳态通过多个过程维持，包括线粒体自噬、线粒体融合和分裂。线粒体自噬主要受PINK1通路调控。ROS水平升高促进PINK1与线粒体外膜结合，最终促进线粒体自噬和线粒体降解。然而，线粒体自噬在NaNO₂和MC-LR诱导的精子发生缺陷中的作用，以及PINK1的调控功能，仍不完全清楚。

针对这一科学问题，郑州大学公共卫生学院的研究团队在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了最新研究成果，系统探讨了NaNO₂和MC-LR联合暴露对小鼠生殖细胞线粒体自噬的影响及其机制。

本研究主要采用了细胞活力检测(CCK8法)、透射电子显微镜观察线粒体超微结构、流式细胞术检测线粒体膜电位(ΔΨ_m)和线粒体活性氧(mtROS)水平、转录组测序分析、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western blot蛋白印迹、siRNA基因沉默技术和自噬小体检测(MDC法)等关键技术方法。研究以小鼠精原细胞系(GC-1)为模型，模拟人体低剂量长期暴露环境。

3.1. NaNO₂和MC-LR联合暴露引起GC-1细胞线粒体损伤

研究人员发现，用1/2 IC₅₀浓度的NaNO₂(8mM)和MC-LR(12μM)处理24小时后，GC-1细胞活力显著降低，且联合暴露组的细胞活性下降比单独暴露组更为明显。透射电镜观察显示，暴露组出现线粒体嵴丢失或减少、肿胀以及自噬小体形成等线粒体损伤特征。同时，NaNO₂和MC-LR导致mtROS水平显著升高，线粒体膜电位(ΔΨ_m)下降，联合暴露组的变化更为显著。

3.2. NaNO₂和MC-LR诱导GC-1细胞RNA表达谱变化

转录组测序结果显示，MC-LR组鉴定出1023个差异表达基因(DEGs)，NaNO₂暴露组鉴定出1362个DEGs，而联合暴露组鉴定出2221个DEGs。交集分析发现三个处理组共有120个差异表达基因，表达模式一致。GO富集分析和KEGG富集分析均显示，细胞周期、自噬、凋亡和线粒体应激等通路显著富集，表明NaNO₂和MC-LR可能通过影响自噬和细胞死亡等生物学过程对GC-1细胞造成损伤。

3.3. NaNO₂和MC-LR对细胞存活和线粒体自噬相关基因表达的影响

研究人员发现多个与细胞存活相关的基因表达发生变化，包括与铁代谢和铁死亡相关的Gpx4、Hmox1、Fth1和Slc7a11，以及与凋亡相关的Caspase-3和Hras。同时，线粒体自噬相关基因如PINK1、Beclin1、P62和Sirt2也显著富集，其中PINK1能够感知线粒体损伤并激活下游通路导致自噬。RT-qPCR验证结果显示，这些基因的表达在NaNO₂和MC-LR暴露后发生显著改变，且联合暴露组的变化比单独暴露组更为明显。

3.4. PINK1介导NaNO₂和MC-LR联合暴露诱导的GC-1细胞线粒体自噬

为探究PINK1在线粒体自噬中的作用，研究人员利用siRNA技术敲低PINK1表达。结果显示，siRNA-4和siRNA-5能有效降低PINK1蛋白表达水平。NaNO₂和MC-LR暴露显著增加PINK1表达及其下游蛋白磷酸化parkin、Atg12、LC3-II等线粒体自噬相关蛋白的水平。而siRNA-4干预显著缓解了parkin磷酸化的增加以及Atg12和LC3-II蛋白表达水平的升高，表明PINK1在NaNO₂和MC-LR诱导的线粒体自噬异常升高中起关键作用。

3.5. MitoQ缓解联合暴露于NaNO₂和MC-LR诱导的GC-1细胞线粒体损伤

MitoQ预处理2小时可显著减弱NaNO₂和MC-LR诱导的PINK1表达上调，表明联合暴露可能通过诱导线粒体氧化应激来增强PINK1表达和线粒体自噬。一致的是，MitoQ预处理也降低了暴露于两种毒素的GC-1细胞中自噬小体荧光强度的升高和自噬溶酶体数量的增加。进一步评估显示，MitoQ显著缓解了NaNO₂和MC-LR引起的细胞融合度和活力下降，证明MitoQ可能通过抑制过度线粒体自噬来保护GC-1细胞免受NaNO₂和MC-LR诱导的损伤。

研究结论与讨论部分强调，在自然环境中，生物体很少暴露于单一污染物。NaNO₂和MC-LR联合暴露是富营养化水体的典型情况，产生的协同毒性效应超过单独暴露。这种相互作用可能损害水生生物的生长、繁殖和行为，导致生物多样性丧失和生态系统不稳定。此外，这些毒素在鱼类和贝类可食用组织中的生物累积增加了人类同时暴露的风险，引发了食品安全和公共健康的担忧。

越来越多的证据表明，环境因素诱导的精子发生障碍是男性不育的主要因素。在常见的水体污染物中，NaNO₂和MC-LR已被证明可破坏雄性生殖系统的线粒体功能并引起氧化损伤。本研究在GC-1细胞中评估了NaNO₂和MC-LR联合暴露的毒性效应，结果突出了PINK1在介导线粒体自噬中的核心作用，并揭示该通路的过度激活 contributes to cellular damage。

本研究首次证实NaNO₂和MC-LR联合暴露会通过激活PINK1通路导致线粒体自噬异常加剧，从而引起细胞损伤，为后续类似复合污染物生殖毒性研究提供了线索。PINK1可作为复合污染生殖毒性的早期预警标志物。针对PINK1靶点，可考虑使用PINK1激动剂或毒素中和剂，以及天然产物或线粒体保护剂进行干预，从而开发更精准的PINK1靶向分子以减轻甚至抵消毒素的毒性。

本研究证实MitoQ能有效缓解PINK1介导的复合污染对生殖细胞的损伤，为开发针对环境污染物诱导生殖损伤的靶向药物提供了参考。然而，某些局限性不容忽视：体外细胞模型不能完全模拟体内生理环境；仅考察了短期(24小时)暴露，而真实世界暴露是长期低剂量的；尽管涉及PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，但具体分子机制需进一步阐明。未来研究应使用动物模型考察长期生殖效应和上游调控通路。

总之，该研究不仅阐明了环境污染物联合暴露的生殖毒性机制，也为开发相应的干预策略提供了重要的理论依据和实验证据，对保护男性生殖健康、应对环境污染物挑战具有重要的科学意义和实际应用价值。