环境DNA代谢条形码引物在评估印度-太平洋鱼类群落多样性中的比较

《Environmental DNA》：Metabarcoding Primers for Indo-Pacific Fishes

　　本研究系统比较了五种常用环境DNA（eDNA）代谢条形码引物（Berry 16S, Leray CO1, MiFish 12S E, MiFish 12S U, Riaz 12S）在模拟群落、水族馆和自然珊瑚礁潟湖三种环境中检测印度-太平洋海洋鱼类多样性的效能。结果表明，靶向12S rRNA区域的引物（尤其是Riaz 12S）在特异性（>98%鱼类序列）和多样性检出（科/种水平）方面总体表现最佳，而引物组合（如Riaz 12S + MiFish 12S E）可最大化物种检出率。研究强调了引物选择、参考数据库完整性及假阳性/阴性识别对eDNA代谢条形码研究准确性的关键影响，为海洋生态学研究提供了重要方法学参考。

　　

引言

环境DNA（eDNA）技术已成为生物多样性评估的强大工具，其应用近年来稳步增长。eDNA研究设计的一个关键方面是选择适当的代谢条形码引物，以有效靶向目标类群。本研究旨在评估五种代谢条形码引物组（Berry 16S、Leray CO1、MiFish 12S E、MiFish 12S U、Riaz 12S）在评估海洋鱼类群落多样性方面的功效。研究在三种环境中进行：已知组成的鱼类组织模拟群落、夏威夷威基基水族馆的封闭水体以及卡内奥赫湾的自然珊瑚礁潟湖。通过对引物性能的多维度比较，为未来在印度-太平洋地区进行的海洋鱼类eDNA代谢条形码研究提供关键的方法学依据。

材料与方法

样本采集与DNA提取

研究使用了三种类型的样本。模拟群落由96种印度-太平洋鱼类的组织DNA提取物按大致相等比例混合而成。水族馆样本采集自威基基水族馆的一个展示缸，其内已知饲养有24种鱼类。自然环境样本则来自夏威夷海洋生物研究所附近的珊瑚礁潟湖，使用无菌尼龙过滤膜过滤海水获得eDNA。所有样本的DNA均使用DNeasy Blood & Tissue Kit进行提取，并设置现场空白、提取空白和PCR空白作为阴性对照。

代谢条形码扩增与测序

研究选择了五个靶向不同线粒体基因区域的引物组进行测试：Berry（16S rRNA）、Leray（CO1）、MiFish-U/-E（12S rRNA，分别偏好扩增硬骨鱼类和软骨鱼类）以及Riaz（12S rRNA）。PCR扩增采用三步法进行，每个样本设置三个技术重复。使用Illumina MiSeq平台进行双端300 bp测序，目标测序深度为每个样本10万条读长。

生物信息学分析

原始测序数据使用rainbow_bridge流程进行处理。首先使用AdapterRemoval v2进行质量过滤和双端序列合并。随后使用OBITools进行引物识别和去除。利用USEARCH软件中的UNOISE3算法将序列去噪和去重复为零宽度操作分类单元（ZOTU），并使用UCHIME2算法去除嵌合体。最后，使用blastn将ZOTU序列与NCBI GenBank核苷酸数据库进行比对，进行物种注释。注释策略采用最低共同祖先（LCA）方法，对于一致性达到100%的匹配直接进行物种注释；对于最佳匹配一致性在97%以上的ZOTU，若多个匹配序列的一致性差异小于1%，则注释至最低共同分类阶元，否则保留最佳匹配的物种级注释。

数据分析

数据分析在R环境中进行。初步检查了各引物在数据过滤前回收的鱼类序列读长和ZOTU的绝对数量和相对比例。随后，将数据集过滤至仅保留脊索动物门（Chordata）的类群，并扣除在阴性对照中出现的类群的读长。最终数据集按唯一的分类学注释进行合并。使用Jaccard距离基于物种存在/缺失矩阵进行群落结构分析，包括置换多元方差分析（PERMANOVA）和主坐标分析（PCoA）。此外，还通过柱状图、热图和UpSet图可视化各引物在科、目水平上回收的序列读长比例和类群组成重叠情况。

结果

总体测序与注释概况

across all samples and controls, a total of 9.9 million reads were obtained. Riaz 12S引物在所有样本类型中均回收了最高比例的鱼类序列读长（模拟群落>99%，水族馆>99%，潟湖>95%）和ZOTUs。相比之下，其他引物在环境样本（水族馆、潟湖）中回收的非目标DNA（如细菌、其他真核生物）比例显著更高。Leray CO1引物在环境样本中几乎未回收鱼类序列。经过数据过滤和空白扣除后，在所有标记和样本类型中共鉴定出71个（模拟群落）、41个（水族馆）和47个（潟湖）鱼类物种。

模拟群落结果

在模拟群落中，所有五种引物组产生的序列中>99%被注释为鱼类。在科水平多样性上，MiFish E和Riaz引物各回收了32个科，两者结合可检测到34个科。PERMANOVA分析表明不同引物回收的群落组成存在显著差异。在96个模拟物种中，有59个被至少一种引物鉴定到物种水平。MiFish E回收了41个预期物种，Berry 16S回收了39个，Riaz回收了36个，MiFish U回收了35个。MiFish E和Riaz 12S引物的组合回收了最多的物种（58个）。钝鼻六鳃鲨和锤头双髻鲨是仅有的被所有五种引物检测到的物种。

水族馆结果

在水族馆样本中，Riaz 12S和MiFish E引物回收的鱼类序列读长比例与模拟群落相似（分别约99%和93%），但鱼类ZOTU的比例分别为88%和3%-18%。Riaz 12S回收了最高的科水平丰富度（21科）。PERMANOVA分析显示标记类型之间存在显著差异。在已知存在于水族馆的24个物种中，只有13个被至少一种引物鉴定到物种水平。各引物还检测到了一些未知存在于缸中的物种（28个），其中许多（如鲑科、鳕科鱼类）很可能来自鱼类饲料。

珊瑚礁潟湖结果

在自然珊瑚礁潟湖样本中，大多数检测到的物种是夏威夷本地种或已知的引入种。Riaz 12S引物再次产生了最高比例的鱼类读长（98%）和科水平多样性（28科），其次是两种MiFish 12S引物（各23科）和Berry 16S（22科）。Riaz 12S也产生了最多的物种级鉴定（30种）。四种鱼类特异性引物均检测到了采样时存在于潟湖中的虎鲨。PERMANOVA分析表明标记之间存在显著差异。检测到了一些非本地或非预期物种，其DNA可能来自用于饲喂潟湖中幼鲨的饵料。

讨论

eDNA代谢条形码研究的准确性受到多种过程的影响，包括DNA提取、PCR扩增偏好性、测序深度、生物信息学分析和参考数据库完整性。本研究表明，引物的特异性至关重要。Riaz 12S引物在所有样本类型中均表现出最高的鱼类序列比例，这大大减少了非目标序列的数量，提高了测序数据的利用效率。然而，在分类分辨率方面存在权衡：虽然Riaz 12S在科水平上多样性最高，但在模拟群落和水族馆样本中，其物种级鉴定数量略低于其他鱼类特异性标记，不过在自然环境中表现最佳。

研究还揭示了假阳性和假阴性检测的问题。假阳性可能来自样本污染（如水族馆饲料）、分类学注释错误（由于参考数据库不完整或近缘种序列相似性高）或环境交叉污染。假阴性则可能由于PCR扩增偏好、序列丰度过低被过滤掉，或与近缘种序列相似性高而被注释至更高阶元（如属）。因此，在研究设计中识别预期物种、考虑潜在的假阳性并进行适当的数据过滤至关重要。

本研究的结论指出，对于印度-太平洋地区的海洋鱼类多样性评估，结合使用Riaz 12S和MiFish 12S E引物可以实现最高的分类群回收率。未来的研究应致力于开发更有效的线粒体引物组，特别是靶向12S基因的区域，并大力支持建立完整、经过验证的组织凭证参考数据库。同时，多重PCR等新技术的应用有望降低使用多组引物的成本，从而更全面地揭示海洋鱼类的多样性。这项研究强调了引物选择对eDNA代谢条形码在海洋生态学研究中准确性的关键影响，为相关方法学的发展提供了重要见解。