水生植物环境DNA检测新突破：基于杂交捕获与PCR扩增子测序的苔藓植物多样性评估

《Metabarcoding & Metagenomics》：?A comparative analysis of hybridisation capture and PCR-based eDNA metabarcoding for monitoring bryophytes in riparian ecosystems

　　本文推荐：针对苔藓植物在生态研究中代表性不足且传统形态学调查存在挑战的问题，研究人员开展了基于环境DNA（eDNA）的苔藓多样性评估方法比较研究。通过比较野外调查、PCR扩增子测序（使用新设计的苔藓偏好性引物对BraF/BraR和rbcL265/rbcL556）和杂交捕获（HC）三种方法，发现PCR扩增子测序能检测到更多物种（101种），而杂交捕获虽检测物种较少（27种），但能发现一些稀有类群。研究表明eDNA方法可有效补充传统调查，尤其适用于检测隐蔽或稀有苔藓物种，为将苔藓植物纳入生物多样性监测计划提供了新途径。

　　

在河流生态系统的生物多样性监测中，苔藓植物常常是被忽视的“沉默多数”。它们虽然体型微小，却在维持水质、防止水土流失以及为微小无脊椎动物提供栖息地方面扮演着关键角色。然而，传统的苔藓植物调查严重依赖于专家的形态学鉴定，这不仅耗时耗力，而且对于体型微小、形态特征不明显的物种，或者仅以原丝体形式存在的物种，极易造成漏检或误判。此外，苔藓植物的生物量通常远低于维管植物，这使得它们在利用环境DNA（eDNA）进行多物种筛查时，其信号很容易被淹没。因此，开发一种能够高效、准确地从环境样本（如河水）中检测苔藓植物多样性的方法，对于将其全面纳入生态评估体系至关重要。

为了应对这一挑战，发表在《Metabarcoding and Metagenomics》上的研究进行了一项开创性的工作，系统地比较了三种评估河岸及河床苔藓植物群落的方法：传统的野外样线调查、基于新设计引物的PCR扩增子测序，以及新兴的杂交捕获技术。研究在法国北孚日山脉地区公园的Falkensteinerbach河流沿线的7个地点进行。研究结果表明，eDNA方法能够有效检测苔藓植物，其中PCR扩增子测序展现了更高的物种检出率，而杂交捕获技术则显示出探测稀有物种的潜力。这项研究证明了分子方法作为传统调查有力补充的价值，为将苔藓植物整合到未来的生物多样性监测和保护政策中铺平了道路。

本研究主要采用了三种关键技术方法：首先是传统的野外样线调查，由苔藓学家沿河岸和河床进行；其次是PCR扩增子测序，研究人员特别针对苔藓植物设计了新的引物对（ITS2标记：BraF/BraR；rbcL标记：rbcL265/rbcL556），并对从河水样本中提取的eDNA进行扩增和Illumina MiSeq测序；第三是杂交捕获技术，针对rbcL和ITS2标记设计RNA探针（baits），用于从eDNA文库中特异性富集苔藓植物的目标序列，随后进行测序。生物信息学分析流程用于处理测序数据并将其与参考数据库进行比对以完成物种鉴定。

研究结果

方法间物种检出比较

综合所有方法，共检测到145种苔藓植物，但仅有9种被所有三种方法共同发现。野外调查识别出68种，其中29种为该方法的独有发现。PCR扩增子测序检出了101种，远超其他方法，并包含了57种未被其他方法检测到的物种。相比之下，杂交捕获方法仅检测到27种，但其独有地发现了9种物种，其中包括一些在该地区被认为非常稀有或稀有的类群，如Dicranella cerviculata和Riccia huebeneriana。这表明不同方法在物种检测上存在显著互补性。

标记基因性能差异

在eDNA方法内部，不同DNA标记的表现也不同。对于PCR扩增子测序，rbcL和ITS2标记分别检测到67和59种物种，但仅有约20%的物种是两者共同检测到的，约40%的物种为各自特有，凸显了多标记联合使用的必要性。在杂交捕获方法中，ITS2标记的检测效果（21种）远优于rbcL标记（6种），这主要归因于较短的rbcL捕获片段（150-220 bp）其物种水平分辨率较低，而ITS2标记则表现出更高的物种分辨率。

群落组成差异

主坐标分析显示，三种方法所揭示的苔藓植物群落结构存在显著差异，表明每种方法都存在特定的检测偏好性。进一步分析未能证实这种差异是由物种的生态偏好（如喜湿性）或扩散特性（如通过孢子体或繁殖体传播）所驱动。指示种分析识别出了一组更倾向于被某种特定方法检测到的物种，表明检测差异更多源于技术方法本身的特性，而非物种的生物学或生态学特征。

研究结论与意义

本研究得出结论，环境DNA（eDNA）方法，特别是使用苔藓偏好性引物的PCR扩增子测序，是评估河流生态系统中苔藓植物多样性的有效工具。它能检测到传统调查可能遗漏的物种（如那些微观生活史阶段或位于调查范围之外的物种），但也可能包含来自上游的“信号”，从而高估局部区域的物种丰富度。因此，eDNA调查提供的是一个空间整合的多样性快照，与传统调查提供的局部精确清单互为补充。

杂交捕获技术在本研究中检测到的物种数量较少，表明该方法在应用于苔藓植物eDNA研究时仍需进一步优化，例如通过使用更长的测序读长来获取信息量更丰富的rbcL基因片段。然而，其在探测稀有物种方面展现的潜力值得关注。

这项研究的意义在于，它首次系统评估并比较了针对苔藓植物的eDNA检测方法，并设计了具有更高特异性的引物，显著提升了检测能力。它证实了分子工具在苔藓植物生态学研究中的可行性，为将这类长期被忽视的植物类群纳入常规生物多样性监测、生态评估以及保护实践（例如对受保护或难以发现的物种进行监测）开辟了新的途径。未来研究可以着眼于优化杂交捕获方案、探索eDNA信号的季节性动态，并持续扩充苔藓植物的DNA条形码参考数据库，以进一步提高物种鉴定的准确性。最终，结合传统调查和现代分子技术，将为我们更全面、深入地理解苔藓植物在生态系统中的角色和动态提供最强大的支持。