蜂巢入口拭子采样：一种非侵入性环境核酸监测方法在蜜蜂病虫害及植物病原体生物安全监测中的应用

《Metabarcoding & Metagenomics》：?Surface swabs outperform most traditional honeybee ( Apis mellifera) hive samples for recovery of eDNA and eRNA

　　本研究针对蜂巢环境核酸(eNA)采样方法优化问题，开展了多种蜂巢样本类型(包括拭子、蜂蜜、花粉和蜜蜂)对细菌(16S)、动物(COI)、真菌(ITS1)、植物(ITS2)和病毒检测效果的比较研究。结果表明，蜂巢入口拭子采样能有效检测广泛的分类群，与直接采样方法相当甚至更优，且具有非侵入性、操作简便等优势，为大规模生物安全监测提供了实用方案。

　　

蜜蜂作为重要的传粉昆虫，其健康状况与农业生产和生态系统稳定息息相关。然而，蜜蜂种群正面临多种威胁，包括病虫害侵袭、农药暴露和栖息地丧失等。及时监测蜂群健康状况及周围环境中的生物风险因素，对于蜜蜂保护和生物安全至关重要。传统的监测方法往往需要对蜂群进行侵入性操作，可能对蜜蜂造成应激，且需要专业人员执行，限制了大规模应用。近年来，环境核酸(environmental nucleic acids, eNA)技术为生物监测提供了新思路。蜂巢作为一个复杂的小生态系统，积累了来自蜜蜂、植物、微生物等多种生物的DNA和RNA，理论上可以通过分析蜂巢内的eNA来了解蜂群健康状况及周围环境生物组成。但究竟哪种蜂巢样本能最有效、最全面地反映生物多样性，仍需要系统评估。

为解决这一问题，研究人员在《Metabarcoding》杂志上发表了一项研究，系统比较了蜂巢入口拭子、蜂巢碎屑拭子、蜂蜜、花粉和蜜蜂等多种样本类型对细菌、动物、真菌、植物和病毒的检测效果。研究发现，蜂巢入口拭子采样是一种高效、非侵入性的方法，能够检测到广泛的生物类群，其效果与甚至优于许多传统的直接采样方法。这一发现为开发适用于大规模蜜蜂生物安全监测和生态环境评估的实用技术提供了重要依据。

本研究采用了多种关键技术方法。研究人员从实验蜂巢中系统采集了蜂巢入口拭子、蜂巢碎屑拭子、蜂蜜、内部花粉、花粉收集器花粉、巢顶蜜蜂和回巢采集蜂共七种样本类型，并设置了样本采集和DNA提取重复。利用代谢条形码(metabarcoding)技术，分别针对细菌(16S rRNA基因)、动物(细胞色素c氧化酶亚基I，COI)、真菌(内源转录间隔区1，ITS1)和植物(内源转录间隔区2，ITS2)的特定DNA条形码区域进行PCR扩增和高通量测序。同时，对部分样本进行RNA测序(RNA-Seq)，使用MetaDIVE流程进行序列组装和病毒鉴定，以评估不同样本类型的病毒检测能力。通过生物信息学分析，比较了各样本类型的分类群检测数量、组成相似性、α多样性等指标。

taxonomic coverage across sample types

研究结果显示，在不同分类群的检测效果上，蜂巢入口拭子和蜂巢碎屑拭子样本在细菌(16S)、动物(COI)和真菌(ITS1)标记上 consistently 检测到最高数量的分类群。对于植物(ITS2)，蜂蜜样本的检测效果最佳，但与拭子样本无显著差异。花粉样本对细菌(16S)和动物(COI)的检测效果相对较差，特别是内部花粉样本对动物(COI)分类群的检测十分有限。真菌(ITS1)的检测在不同样本类型间变异较大。值得注意的是，各样本类型对每个标记物中最常见的10个属的检测表现出高度一致性，表明不同采样方法能捕获到相似的核心生物类群。

effect of replicates on taxonomic coverage

关于采样重复对分类群覆盖度的影响，研究发现不同样本类型和提取重复间的 taxa 检测存在相当大变异。真菌(ITS1)的平均重复间重叠百分比最低(19.1%-40.6%)，表明 taxa 检测的高变异性。细菌(16S)的变异受样本类型影响，蜜蜂样本显示最高的平均重复间重叠百分比(83.8%-86.5%)，而花粉样本最低(39%-43.3%)。当比较连续拭子采样重复时，发现后续拭子新检测到的独特分类群数量呈下降趋势，表明前两次拭子采样已能捕获大部分多样性，特别是对于细菌、动物和植物标记物。然而，真菌标记物在第三次拭子重复中仍能检测到相当数量的新分类群。

RNA sequencing analysis

RNA测序分析结果显示，不同样本类型在病毒检测方面各有特点。蜂蜜样本检测到的病毒种类最多(平均23种/样本)，但在病毒读长和重叠群(contig)长度上最低。蜂巢入口拭子和巢顶蜜蜂样本分别平均检测到16和14种病毒，而内部花粉样本检测到的病毒最少(平均7.73种)。就病毒宿主类型而言，所有四种样本类型均能检测到真菌和植物病毒，但比例不同。蜂蜜样本包含最多的植物病毒(23种)，而蜂巢入口拭子样本包含最多的真菌病毒(10种)。蜜蜂特异性病毒在蜜蜂样本中最为丰富(7种)，蜂蜜和蜂巢入口拭子样本中也检测到此类病毒。

研究结论表明，蜂巢入口拭子采样是一种有效的蜂巢eNA监测方法，能够检测广泛的生物类群。与常见的蜂巢样本类型相比，蜂巢入口拭子能恢复相似的分类群组成，同时还能检测到额外的分类群，特别是细菌和真菌类群。两个拭子重复足以捕获大部分分类群多样性，进一步增加重复的收益递减。蜂巢入口拭子采样还具有非侵入性、操作简便、适合全年采样且可由非专业人员执行等实用优势。这些特点结合其广泛的分类群覆盖度，使蜂巢入口拭子采样成为大规模生物安全监测和生物多样性评估的有力工具。

该研究的重要意义在于为蜜蜂健康监测和生物安全评估提供了一种优化、实用的采样策略。通过利用现有的蜂巢网络和这种简单的拭子采样方法，可以建立一种高度可扩展的策略，用于检测不同景观中的蜜蜂病虫害、植物病原体及周围植被。这种方法特别适合于大规模生物安全监测项目，有助于早期发现新传入的有害生物，保护蜜蜂种群和农业生产安全。未来研究可以进一步探讨eNA在蜂巢中的持久性、蜂群间的变异性以及检测限度等问题，以提高这种监测方法的可靠性和应用范围。