FEOX：一种基于血赤蛋白结构域的新型基因编码铁生物传感器实现单细胞水平细胞铁环境动态监测

《Scientific Reports》：The genetically encoded biosensor FEOX is a molecular gauge for cellular iron environment dynamics at single cell resolution

　　本研究针对缺乏能够在单细胞分辨率和发育时间尺度上量化细胞内铁状态的基因编码工具这一难题，开发了基于FBXL5血赤蛋白样结构域的比率型荧光生物传感器FEOX。研究证实FEOX通过铁依赖性蛋白稳定性调控机制，成功实现了对干细胞早期分化过程中铁环境动态变化的单细胞水平监测，为研究细胞铁稳态提供了与IRP活性正交的独立观测手段。

　　

铁是生命活动中不可或缺的微量元素，参与氧气运输、能量代谢和DNA合成等关键生理过程。在哺乳动物细胞中，铁稳态主要由铁调节蛋白（IRPs）通过转录后调控机制维持。当细胞内铁含量不足时，IRP1和IRP2会与特定mRNA结合，调控铁代谢相关基因的表达。然而，科学界长期缺乏能够在单细胞水平实时监测生物可利用铁动态变化的基因编码工具，这限制了对发育和分化过程中铁代谢调控机制的深入理解。

为了突破这一技术瓶颈，研究人员开发了名为FEOX的新型基因编码生物传感器。该传感器的设计灵感来源于FBXL5蛋白的血赤蛋白样（hemerythrin-like, Hr）结构域，该结构域在进化上高度保守，能够通过其二铁中心特异性地感知细胞内铁浓度。在铁充足条件下，铁结合稳定FBXL5蛋白，进而促进IRP2的泛素化降解；而在铁缺乏时，FBXL5自身被降解，IRP2得以稳定并发挥RNA结合活性。

FEOX传感器的核心设计是将人源FBXL5的Hr结构域与荧光蛋白融合，利用该结构域的铁依赖性稳定性调控特性，将细胞内铁浓度变化转化为荧光信号变化。传感器采用双 cassette设计，分别包含与Hr结构域融合的mTagBFP2（传感器）和独立的mCherry（内参），通过两种荧光信号的比率计算（FEOX Ratio）实现定量测量。

主要技术方法

研究使用piggyBac转座子系统将FEOX传感器稳定整合到小鼠胚胎干细胞（ESCs）基因组中，通过流式细胞术分选和单克隆筛选获得稳定表达细胞系。利用铁螯剂deferoxamine（DFE）和铁补充剂柠檬酸铁铵（FAC）建立铁梯度处理，通过流式细胞术和荧光显微镜分析传感器响应特性。在干细胞分化模型中，通过撤除LIF/2i诱导多能性转变和早期分化，分别在二维（2D）培养和三维（3D）拟胚体（EBs）体系中评估铁环境动态变化。

FEOX是基于哺乳动物血赤蛋白样结构域的比率型细胞铁环境生物传感器

研究人员成功构建了FEOX传感器系统，该传感器在铁限制条件下显示比率荧光降低，表明细胞内铁水平下降。与反映IRP活性的FIRE传感器相比，FEOX对铁缺乏表现出更高的敏感性，而对铁过载的反应相对有限。这一特性使FEOX特别适用于生理性铁水平的研究，尤其是在铁缺乏条件下的动态监测。

比率定量通过FEOX揭示早期ESC分化过程中细胞铁环境的动态变化

研究发现，在干细胞从初始多能性向 formative state 转变过程中，FEOX比率显著降低，表明分化早期伴随细胞内铁水平的下降。这一现象在2D和3D培养体系中均得到验证，与FIRE传感器检测到的IRP活性增加相吻合，共同支持了分化早期存在铁需求增加状态的理论。

讨论

FEOX传感器的开发填补了细胞铁代谢研究领域的重要技术空白。与传统的化学探针相比，FEOX具有基因编码、比率定量、单细胞分辨率等优势，能够长期追踪细胞内铁环境的动态变化。该传感器与FIRE传感器的联合使用，为研究IRP依赖性和非依赖性铁调控机制提供了正交验证手段。

研究证实，干细胞分化早期存在明显的铁环境重编程，这一发现为理解细胞命运决定过程中的代谢调控机制提供了新视角。未来，FEOX技术平台有望广泛应用于发育生物学、疾病模型和药物筛选等领域，为解析铁代谢在生理病理过程中的复杂调控网络提供有力工具。

需要注意的是，FEOX主要反映细胞质整体的铁水平，对细胞器特异性铁分布的解析能力有限，且对超高铁浓度的响应动态范围较窄。然而，其在生理条件下的敏感性和单细胞定量能力，使其成为研究动态生物过程中铁代谢调控的独特工具。