恶臭假单胞菌KT2440异源合成鼠李糖脂的酰基载体蛋白依赖性及脂肪酸代谢作用研究

《Applied and Environmental Microbiology》：Heterologous rhamnolipid biosynthesis by P. putida KT2440—ACP dependency and the role of fatty acid metabolism

　　本研究通过立体化学分析、β-氧化缺陷菌株构建及13C标记实验，揭示了恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440异源合成鼠李糖脂(rhamnolipids)过程中，酰基转移酶RhlA对酰基载体蛋白(ACP)活化底物的强偏好性，并证实脂肪酸需经完全β-氧化降解为乙酰辅酶A(acetyl-CoA)后，通过脂肪酸从头合成(FAS)途径整合入鼠李糖脂疏水模块，为优化非致病性宿主高效生产这种环保生物表面活性剂提供了关键代谢见解。

　　

引言

鼠李糖脂是一类由L-鼠李糖作为亲水部分和3-(3-羟基烷酰氧基)烷酸(HAA)作为疏水部分组成的糖脂类生物表面活性剂。由于其高表面活性、良好的生物降解性、低毒性以及广泛的应用潜力（如洗涤剂、化妆品、食品和制药行业），鼠李糖脂受到了广泛关注。尽管鼠李糖脂已被深入研究并实现工业化生产，但其生物合成途径，特别是疏水部分HAA的合成来源，尚未完全阐明。在恶臭假单胞菌KT2440等异源宿主中生产鼠李糖脂时，了解其合成途径对于通过代谢工程优化生产至关重要。

鼠李糖脂的生物合成最后几步酶促反应是明确的：酰基转移酶RhlA催化两个活化的羟基脂肪酸二聚化形成HAA；鼠李糖基转移酶RhlB利用dTDP-L-鼠李糖将HAA连接成一个鼠李糖分子，形成单鼠李糖脂；第二个鼠李糖基转移酶RhlC则催化第二个鼠李糖的连接，形成双鼠李糖脂。亲水部分L-鼠李糖的合成途径是清楚的，但疏水部分羟基脂肪酸的前体来源存在争议。潜在的前体可能来自脂肪酸从头合成(FAS)途径产生的(R)-3-羟基酰基-ACP，或者来自β-氧化途径产生的(S)-3-羟基酰基-CoA。这两种来源的分子在立体化学构型和活化形式上都不同。RhlA对其中一种或两种底物的特异性是关键因素。先前研究存在矛盾：有些指出CoA活化的羟基脂肪酸是RhlA的底物，而另一些使用纯化RhlA的研究则发现其只接受ACP活化的底物。此外，也有研究提出了β-氧化和FAS途径的结合，或者通过RhlYZ（一种(R)-特异性烯酰基-CoA水合酶/异构酶复合物）将β-氧化中间体导向鼠李糖脂合成。本研究旨在利用恶臭假单胞菌KT2440这一安全的异源生产宿主，通过分析鼠李糖脂的立体化学、构建β-氧化缺陷突变株以及进行¹³C标记实验，来阐明鼠李糖脂疏水部分的生物合成途径。

材料与方法

本研究使用了多种恶臭假单胞菌KT2440的衍生菌株，包括野生型KT2440、β-氧化缺陷型突变株KTQQ20（缺失fadB, fadA, fadB2x, fadAx, PP2047, PP2048, phaG）以及在此基础上进一步删除PP_3754-55（推测的fadBA同源基因）的双突变株。通过染色体整合迷你Tn7转座子（携带来自铜绿假单胞菌PAO1的rhlAB基因）构建了能够生产鼠李糖脂的工程菌。菌株在含有不同碳源（如葡萄糖、辛酸、癸酸、十二酸）的矿物盐培养基或M9培养基中培养。用于¹³C标记实验时，使用了U-¹³C₆葡萄糖与未标记的脂肪酸组合。

分析手段包括：使用配备电雾式检测器(CAD)的高效液相色谱(HPLC)定量鼠李糖脂；通过酸性水解鼠李糖脂释放3-羟基脂肪酸，再经甲基化和Mosher试剂衍生化后，使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析其立体化学构型；使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析¹³C标记鼠李糖脂的同位素分布，并计算标记分数(FL)；使用GC-MS分析蛋白质氨基酸的¹³C标记情况以评估中心碳代谢通量。此外，还通过RNA测序(RNA-Seq)分析了菌株在不同碳源上的基因表达差异。

结果

鼠李糖脂中的羟基脂肪酸仅呈现(R)-构型

对铜绿假单胞菌PAO1和恶臭假单胞菌KT2440 SK4在不同碳源（葡萄糖、植物油、癸酸、十四酸）上生产的鼠李糖脂进行立体化学分析发现，无论碳源如何，产生的鼠李糖脂中的3-羟基脂肪酸（C10, C12, C14）几乎完全（>99%）为(R)-构型，仅在PAO1的少量样品中检测到痕量的(S)-构型（<1%）。在恶臭假单胞菌KT2440 SK4以脂肪酸为底物时，只检测到(R)-构型。这表明RhlA对(R)-构型的底物具有严格特异性。由于FAS产生(R)-3-羟基酰基-ACP，而β-氧化产生(S)-3-羟基酰基-CoA，这一结果强烈暗示前体来源于FAS途径。虽然假单胞菌中存在(R)-特异性烯酰基-CoA水合酶PhaJ，可将β-氧化中间体转化为(R)-3-羟基酰基-CoA，但后续实验表明该CoA活化形式可能并非RhlA的直接底物。

β-氧化缺陷菌株无法利用脂肪酸合成鼠李糖脂

为了验证β-氧化的作用，研究使用了β-氧化缺陷菌株P. putida KTQQ20（缺失多个fadBA同源基因）及其衍生菌株。KTQQ20仍能利用癸酸生长并产生鼠李糖脂，但产量低于野生型。进一步删除其基因组中残留的一个fadBA同源基因簇PP_3754-55后，得到的双突变株KTQQ20 ΔPP_3754-55-RL完全丧失了在癸酸作为唯一碳源时的生长能力和鼠李糖脂生产能力。然而，当该菌株在葡萄糖和癸酸混合底物上培养时，虽然能利用葡萄糖生长（并显示双相生长曲线，暗示后期可能利用了癸酸），但其鼠李糖脂产量与仅用葡萄糖时相当，说明癸酸未能被有效用于鼠李糖脂合成。这表明脂肪酸不能直接或通过PhaJ途径产生的(R)-羟基酰基-CoA被整合进鼠李糖脂，必须依赖于功能完整的β-氧化系统。通过重新在双突变株中引入fadB（PP_2136），恢复了菌株在癸酸上的生长（尽管速率较低）和鼠李糖脂生产能力，且产量甚至高于野生型，进一步证实了FadB（以及完整β-氧化）在提供前体中的关键作用。转录组分析显示，在癸酸上生长时，多个fadBA同源基因（如PP_2047, PP_2048, PP_2051, PP_3754, PP_3755）表达显著上调，解释了KTQQ20中残留的β-氧化活性。

¹³C标记实验揭示脂肪酸完全降解为乙酰辅酶A

为了追踪碳原子流向，研究进行了¹³C标记实验。将恶臭假单胞菌KT2440 SK4在含有¹³C标记葡萄糖和未标记脂肪酸（辛酸、癸酸或十二酸）的等碳摩尔混合底物上培养，并分析产生的鼠李糖脂（以Rha-C₁₀-C₁₀和HAA C₁₀-C₁₀为主）的同位素标记模式。

当仅使用¹³C葡萄糖时，产生的鼠李糖脂和HAA几乎完全标记（FL约98%），符合预期。

在葡萄糖（标记）与脂肪酸（未标记）共培养时，情况则不同。对于Rha-C₁₀-C₁₀，最丰富的离子峰对应m+6（即鼠李糖部分带有6个¹³C原子），这表明亲水部分确实来源于标记的葡萄糖。然而，也检测到了从m+5到m+26（完全标记）的一系列离子峰，表明疏水部分的脂肪酸链中也掺入了来自葡萄糖的标记碳原子。HAA C₁₀-C₁₀的标记分数（18%-33%）低于完整的鼠李糖脂（42%-46%），因为后者还包含了标记的鼠李糖。这些结果表明，外源脂肪酸没有被直接用作延长单元整合到鼠李糖脂的疏水链中，而是必须先经过β-氧化循环降解。标记碳出现在脂肪酸链中，意味着至少部分脂肪酸碳骨架被完全降解为乙酰辅酶A，然后该乙酰辅酶A库（由标记葡萄糖和未标记脂肪酸降解产生的乙酰辅酶A混合而成）被用于FAS从头合成羟基脂肪酸前体。如果脂肪酸被直接 incorporation 或仅经过不完全β-氧化，则不会出现来自葡萄糖的碳原子广泛掺入疏水部分的现象。

对β-氧化严重受损的双突变株KTQQ20 ΔPP_3754-55-RL在¹³C葡萄糖和未标记十二酸上生产的鼠李糖脂进行分析，发现其标记分数（83%）高于野生型在混合底物上的情况，但并非完全标记。这暗示该突变株中仍存在微弱的β-氧化活性，使得少量未标记的脂肪酸衍生碳能够进入鼠李糖脂。

对氨基酸标记的分析为乙酰辅酶A库的混合来源提供了进一步证据。在葡萄糖和癸酸共培养时，完全由葡萄糖代谢中间体衍生的氨基酸（如丝氨酸、丙氨酸）标记率较高（~80%），而部分碳原子来源于乙酰辅酶A或TCA循环的氨基酸（如亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸）标记率较低（42%-62%）。计算表明，乙酰辅酶A库中约有21%的碳原子来源于未标记脂肪酸的降解，其余则来源于标记葡萄糖的代谢。这与鼠李糖脂标记数据一致，共同支持了脂肪酸底物需完全降解为乙酰辅酶A后才能用于鼠李糖脂合成的结论。

讨论

本研究综合运用立体化学分析、遗传学手段和同位素标记技术，清晰地揭示了在恶臭假单胞菌KT2440中，鼠李糖脂疏水部分的生物合成高度依赖于脂肪酸从头合成(FAS)途径。关键酶RhlA表现出对ACP活化的(R)-3-羟基脂肪酸底物的强烈偏好性。当以脂肪酸为底物时，它们不能直接或通过PhaJ途径产生的(R)-3-羟基酰基-CoA被RhlA利用，而是必须经过完整的β-氧化途径彻底分解为乙酰辅酶A。随后，这些乙酰辅酶A单元（与来自其他碳源如葡萄糖的乙酰辅酶A混合）作为FAS的起始原料，重新合成(R)-3-羟基酰基-ACP，进而被RhlA用于HAA和鼠李糖脂的合成。

这一发现与在另一种天然鼠李糖脂生产者泰国伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis)中的研究结果一致，但与铜绿假单胞菌中某些认为β-氧化中间体可通过RhlYZ等酶直接导向鼠李糖脂合成的模型不同。本研究强调了不同生产菌株间代谢途径可能存在差异，即使是结构相似的分子（如鼠李糖脂和聚羟基脂肪酸酯PHA），其前体供应途径也可能不同（例如，PhaG和PhaJ在PHA合成中起作用，但本研究显示它们不参与鼠李糖脂合成）。

结论

本研究成功阐明了恶臭假单胞菌KT2440异源合成鼠李糖脂时疏水模块的生物合成途径，明确了FAS的核心贡献和β-氧化的必要预处理角色。这些发现为在该非致病性宿主中进行理性的代谢工程改造以优化鼠李糖脂生产奠定了坚实的理论基础。通过增强乙酰辅酶A供应、调控FAS通量或消除竞争途径，有望进一步提高鼠李糖脂的产量和效率，推动这种绿色生物表面活性剂的工业化应用。