XoxF蛋白和Calvin-Benson循环在Bradyrhizobium和Sinorhizobium菌中调控了对甲醇生长的依赖性，这种生长依赖于镧系元素的存在

《Applied and Environmental Microbiology》：XoxF and the Calvin-Benson cycle mediate lanthanide-dependent growth on methanol in Bradyrhizobium and Sinorhizobium

　　氮固定细菌如Bradyrhizobium和Sinorhizobium通过镧系元素依赖的XoxF酶催化甲烷氧化为甲酸盐，经谷胱甘肽相关途径和NAD+依赖性甲酸脱氢酶转化为CO?，最终通过CBB循环固定CO?。转录组学、蛋白组学和同位素标记证实该代谢途径在三种菌株中均存在，且镧系浓度影响生长速率。首次报道Sinorhizobium依赖XoxF-CBB途径代谢甲烷，并揭示其与植物共生相关的基因簇分布特征。

　　在植物健康和营养领域，结节形成细菌扮演着至关重要的角色，它们通过固氮作用为豆科植物提供固定的氮。尽管这一关系的重要性已被广泛认可，但关于这些细菌如何受到植物分泌物和土壤矿物质影响的研究仍不充分。本文旨在探讨植物来源的甲醇和镧系金属对固氮细菌——特别是属于Rhizobiales的细菌——生长的影响。此前的研究表明，某些Bradyrhizobium菌株只能在存在镧系金属的情况下吸收甲醇，但其代谢路径仍不清楚。因此，本研究通过分析Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110、Bradyrhizobium sp. USDA 3456以及Sinorhizobium meliloti 2011的基因组，确定了甲醇代谢的路径，涵盖了之前已知菌株、其他Bradyrhizobium菌群以及更远亲缘关系的Sinorhizobium。

根据基因组分析，我们假设这些微生物的甲醇吸收过程通过镧系金属依赖的甲醇脱氢酶XoxF进行，随后通过谷胱甘肽连接的氧化途径将甲醛氧化，再通过甲酸脱氢酶（FDH）将甲酸氧化为二氧化碳（CO?），最后通过卡尔文-本森-巴斯哈（CBB）循环将CO?同化为生物质。转录组学分析显示，在使用甲醇生长的Bradyrhizobium sp. USDA 3456中，上述代谢途径的基因表达显著上调。酶活性实验表明，所有菌株在甲醇生长条件下，谷胱甘肽连接的氧化途径和甲酸脱氢酶的活性均高于在琥珀酸生长条件下。13C标记实验进一步确认了CBB循环中间产物的存在和标记的掺入。这些发现提供了多方面的证据支持XoxF-CBB代谢路径的假设，并结合基因组分析，表明这种代谢在Bradyrhizobium和Sinorhizobium物种中具有普遍性。

研究的背景在于，固氮土壤细菌如Bradyrhizobium和Sinorhizobium在促进植物生长和减少对人工、高能耗肥料的依赖方面具有重要作用。许多研究试图通过识别促进成功共生关系的微量元素和植物分泌物来增强细菌的固氮作用和植物组织的定植。然而，尽管有报道表明植物生长受到镧系金属的影响，这些金属在植物根际微生物代谢中的作用却鲜有关注。本研究对三种农业相关的Bradyrhizobium和Sinorhizobium菌株进行了表征，证实了它们在存在镧系金属时能够利用甲醇，并通过实验确定了这一代谢过程的路径。这为理解Bradyrhizobium和Sinorhizobium的镧系金属依赖代谢及其对环境微生物生理和丰度的影响奠定了基础。

甲醇作为植物环境中丰富的挥发性碳源，其来源主要是植物组织中果胶甲基酯酶的活性，这些酶从活体植物组织和植物残体中释放甲醇。在植物的地上部分，甲醇已被证明可以促进某些能够利用甲醇作为唯一碳源和能量来源的甲醇营养型细菌（methylotrophs）的定植，使它们能够竞争非甲醇营养型菌株。然而，关于土壤中甲醇的代谢以及固氮细菌的相关研究仍较少。已有研究指出，Bradyrhizobium能够在草地土壤和根际环境中同化甲醇，但具体机制尚不清楚。

镧系金属（Ln）在多种植物相关细菌中作为甲醇代谢的必需辅因子。这些金属在某些吡咯喹啉醌（PQQ）甲醇脱氢酶（PQQ-MDH）中起关键作用，这些酶将甲醇氧化为甲醛。Ln依赖的PQQ-MDH XoxF首次在2011年被证明功能正常且需要Ln。为了促进Ln的结合，XoxF在活性位点包含额外的天冬氨酸，这一残基对Ln的结合和催化至关重要，并被用于预测Ln依赖性。Ln通过肥料引入土壤，因此它们可能影响土壤微生物的生理，包括Bradyrhizobium和Sinorhizobium。

PQQ-MDHs如XoxF和MxaF的活性会产生甲醛，这是一种具有反应性的亲电物质，能够与DNA和蛋白质形成交联。多种途径可用于氧化甲醛并生成NAD(P)H，但四氢甲基叶啉（H?MPT）和谷胱甘肽（GSH）连接的氧化途径最为常见。Methylobacterium、Hyphomicrobium以及许多甲烷氧化菌依赖H?MPT途径进行甲醛氧化。而GSH连接的途径则在Methylobacterium aquaticum 22A和Rhodobacter sphaeroides中被证明在甲醛氧化中起支持作用，并且是Paracoccus denitrificans生长所需的。这些途径使用不同的碳载体（H?MPT或谷胱甘肽），但反应步骤相似：首先将甲醛共价连接到各自的碳载体上，然后氧化甲酰基团，最后将甲酰基碳从载体中释放出来，以回收载体并生成甲酸。甲酸可以通过甲酸脱氢酶（FDHs）进一步氧化为CO?，并通过CBB循环进行同化。

在Bradyrhizobium和Sinorhizobium中，甲醇可以被同化到CBB循环的多个步骤，包括甲醛、甲酸或CO?。然而，这些菌株具体的同化路径尚未明确。在I型甲醇同化中，Gamma-和Betaproteobacteria使用RuMP途径将甲醛纳入其代谢。II型甲醇同化则在甲酸水平进行碳同化，这一类群主要包括Alphaproteobacteria，如模型甲醇同化菌Methylobacterium extorquens AM1。在M. extorquens AM1中，大约50%的甲酸被氧化为CO?以生成NAD(P)H，其余50%则被纳入丝氨酸循环。此外，乙基马来酰辅酶A（EMC）途径被用于再生甘油醛。相比之下，CBB循环虽然看起来效率较低，因为CO?固定需要较高的能量，但在某些固氮Alphaproteobacteria中已被验证可用于甲醇生长，如Beijerinckia mobilis和Xanthobacter flavus，以及verrucomicrobial甲烷氧化菌Methylacidiphilum fumariolicum SolV和Gammaproteobacteria甲烷氧化菌Methylococcus capsulatus Bath。

基于生物信息学分析，我们假设Bradyrhizobium和Sinorhizobium的甲醇代谢通过XoxF-CBB路径进行。这一路径包括：利用Ln依赖的XoxF氧化甲醇为甲醛，随后通过GSH连接的氧化途径将甲醛转化为甲酸，再通过FDHs将甲酸氧化为CO?，最后通过CBB循环将CO?同化为生物质。这一假设得到了转录组学、蛋白质组学、代谢组学和生化研究的支持，特别是在Bradyrhizobium sp. USDA 3456中，XoxF-CBB路径被证明是活跃的。此外，我们通过蛋白质组学和生化实验确认了XoxF-CBB路径在另一个物种Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110以及更远亲缘关系的Sinorhizobium meliloti 2011中运行。这是首次报道Sinorhizobium的Ln使用和甲醇同化。生物信息学分析表明，这种代谢路径在固氮Rhizobiales中普遍存在，包括Bradyrhizobium、Sinorhizobium和Mesorhizobium。

在实际应用中，了解Ln对土壤微生物的影响对于农业实践至关重要，因为Ln在商业肥料中被有意或无意地引入土壤，影响微生物的生长和作物的生产力。甲醇的代谢不仅影响微生物的生长，还可能影响植物的健康和生长。因此，进一步研究XoxF-CBB路径在自然环境中的功能条件以及其对微生物代谢和植物健康的影响是必要的。此外，通过基因组分析，我们发现某些Rhizobiales菌株在基因组中编码了XoxF、GSH连接的氧化途径、FDHs和CBB循环所需的基因，表明这些菌株可能具备利用甲醇进行生长的能力。这一发现有助于更好地理解甲醇和Ln对固氮细菌及农业环境的影响。