沙尘暴露通过改变肺部微生物群诱发中性粒细胞炎症的机制研究——以索尔顿海干涸湖床粉尘为例

《mSphere》：Lung microbiomes’ variable responses to dust exposure in mouse models of asthma

　　本研究发现，吸入来自干涸湖泊（如加州索尔顿海）的粉尘会显著改变小鼠肺部微生物群（Lung Microbiome）结构，并诱发以中性粒细胞（Neutrophil）为主导的肺部炎症。研究通过环境暴露舱实验证实，粉尘来源（如近湖的Wister点与较远的Palm Desert点）和采集时间（如WI2020与WI2021）差异导致肺部微生物群落组成（β-多样性）和多样性（Shannon-Wiener指数）发生特异性改变，且这种改变独立于炎症程度。研究强调了粉尘相关微生物残留物及化学组分对呼吸系统健康的潜在影响，为干旱地区因气候变化导致的公共健康风险提供了重要见解。

　　

引言

随着干旱地区污染和气候变化的加剧，风携带的松散沉积物和沙尘（Dust）可能在整个区域传播有毒的地球化学物质和微生物负荷。当吸入的环境粉尘与宿主相关微生物组（Microbiome）混合时，会对宿主呼吸健康构成暴露风险。加利福尼亚州最大的湖泊——索尔顿海（Salton Sea）正在萎缩，导致附近社区暴露于干涸湖床（Playa）的粉尘中。因此，本研究旨在利用小鼠模型分析索尔顿海粉尘暴露的影响，以阐明肺部微生物群落（Lung Microbial Communities）与呼吸健康之间的关系。

吸入粉尘中的物质可能损害肺部健康。在正常呼吸过程中，来自风成环境（Aeolian Environment）的外来物质持续进入哺乳动物呼吸道。宿主相关的机制，如粘膜纤毛清除作用（Mucociliary Action）、抗菌肽（Antimicrobial Peptides）以及先天或适应性免疫（Innate or Adaptive Immunity），有助于清除这些物质和其他潜在有害因子。然而，这些因子频率或负荷的增加可能压倒或绕过这些机制，导致肺部菌群失调（Pulmonary Dysbiosis）并引发呼吸窘迫。

在免疫正常的个体中，呼吸道是低生物量（Low-Biomass）微生物群落的家园。尽管呼吸道曾被认为是无菌的，但现在推测人类呼吸道中的微生物是偶然吸入和微吸入（Micro-Aspiration）的结果。虽然上呼吸道的微生物被发现可以支持宿主清除机制并协助防御有害外来因子的负荷，但微生物在人类气道中的扩散可能由于分类学、功能或共生活动（Commensal Activities）而促进生态位分区（Niche Partitioning）。微生物群之间的代谢和生态生理学差异，包括致病性（Pathogenicity），以及微生物组对人类生理学和疾病的重要性，强调了在该系统中考虑呼吸道微生物组组成的必要性。

由于肺部微生物组结构与宿主免疫系统的发育和调节相关，肺部微生物组可能直接影响或响应宿主肺部疾病。在各种疾病状态下，患有哮喘（Asthma）、慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease）和囊性纤维化（Cystic Fibrosis）的患者的肺部微生物组成和多样性会发生改变。然而，尚不清楚宿主的肺部微生物组谱是否能明确区分健康和患病的肺部表型。虽然肺部炎症反应可能与肺部微生物群落的组成变化相关，但这些反应可能取决于时间、气候和其他外部变量，包括持续暴露于环境气溶胶（Environmental Aerosols），正如索尔顿海盆地及其周边居民所怀疑的那样。

本研究旨在表征环境诱导的气溶胶化粉尘暴露下的肺部微生物组，并与基线状态进行比较。我们让小鼠长期暴露于在加利福尼亚州索尔顿海附近收集的粉尘下，这些粉尘已被证明能在小鼠肺部引发急性先天免疫反应（Acute Innate Immune Response）。由于短期暴露于在远离索尔顿海的地方收集的可比沙漠粉尘会产生减弱的免疫反应，我们实验使用了在靠近和远离索尔顿海的地点收集的粉尘，以比较暴露对肺部微生物组的影响。

材料与方法

沙尘收集与处理

被动粉尘收集器（Passive Dust Collectors）被部署在距离索尔顿周边不同距离的两个地点。棕榈沙漠（Palm Desert, PD）地点（33°46′25.7″N, 116°21′10.3″W）距离湖床最近的水线25.5英里，作为地理对照点。威斯特（Wister, WI）地点（33°17′01.9″N, 115°36′00.3″W）位于索尔顿海东南边缘不到2英里处，根据先前研究，来自该地点的粉尘 consistently 在小鼠系统中引起组织学炎症反应并加剧肺部健康状况。我们选择了两个部署时间点：2020年8月至10月（WI2020）和2021年9月至12月（WI2021和PD2021），因为先前的图示分析和免疫学分析显示这些时间点的威斯特粉尘中有机物水平较高。

部署期结束后，用MilliQ水冲洗粉尘收集器，水悬浮液通过0.2微米网格过滤。由于网格的孔径足够大，可以让水和矿物质通过，但太小而无法让完整的微生物细胞通过，剩余的冻干浓缩滤液应大部分不含存活的、完整的微生物细胞。随后，在雾化之前，将这种浓缩滤液重新悬浮在MilliQ水中。

动物实验

使用了八至九周大的雄性和雌性C57BL/6小鼠。小鼠在用于我们的暴露室研究之前，在特定无病原体（Specific-Pathogen-Free）动物房中适应约一周。

暴露室实验

将装有3-4只C57BL/6小鼠的笼子在两个540升的处理室（暴露室和对照室）之间随机分配，这些处理室模仿先前描述的模型。雄性和雌性小鼠的数量均匀分布在两个处理组中。小鼠在各自的处理室中保持7天，根据需要获取食物和水。

对于每次实验，暴露室中充满干燥的过滤空气；对于实验性粉尘处理，我们将这种过滤空气与通过硅胶干燥柱雾化的滤液悬浮液混合。在整个实验期间，滤液浓度维持在大约1,500 μg/m3。相比之下，同时期的对照室仅接收干燥的过滤空气。这些对照空气小鼠用于在本研究背景下定义“基线”表型，基于预期该组在7天暴露期结束时表现出相对的环境炎症。

下呼吸道解剖与处理

在7天暴露室实验期结束时，用异氟烷（Isoflurane）和颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。对每只动物在中气管处提取下呼吸道（Lower Respiratory Tract, LRT）组织，并在气管分叉处分离肺叶，然后储存于-80°C供下游使用。

收集额外的肺组织和支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF）用于随后分析宿主免疫反应。用荧光抗体对BALF样本进行染色，并使用流式细胞仪进行分析。

肺部微生物组文库制备与测序

使用HostZERO微生物DNA提取试剂盒从全肺或半肺叶中提取微生物DNA，并遵循制造商对固体组织样本方案的修改版本。使用2毫米珠子在MP Bio Fastprep Classic上进行组织裂解，最大速度1分钟，然后进行2分钟离心以分离真核和微生物组分。经过两次混合和离心循环后，重悬沉淀并进行三次孵育。然后将溶液转移到含有0.1和0.5毫米珠子的裂解管中，进行五个裂解循环和5分钟冰上孵育，随后进行离心和下游DNA提取。我们修改了该方案，通过将总共700 μL上清液转移到每个全肺或半肺样本的两个平行提取中，以最大化微生物提取过程，随后将其合并为该特定动物的单一DNA模板。

由于肺部以低微生物生物量为特征，在DNA提取过程中使用阴性对照来控制下游分析中潜在的污染物。使用Qubit对DNA提取物进行定量；与来自肺部样本的模板相比，阴性对照样本中的双链DNA质量浓度（每微升）无法检测到。将具有可检测DNA浓度的提取物送交进行16S V3–V4 rRNA基因区域的目标扩增子（Targeted-Amplicon）文库制备。

在文库制备之前，使用OneStep PCR抑制剂去除试剂盒进行PCR抑制剂去除步骤。在此步骤之后，使用Quick-16S NGS Library Prep Kit对V3和V4区域进行16S rRNA扩增，并添加线粒体序列特异性肽核酸（即线粒体阻断剂）夹，以最小化真核线粒体DNA的扩增。在整个扩增流程中保持阴性对照以追踪污染和方案有效性。使用Illumina NextSeq2000和P1试剂盒（600个循环）以及30% PhiX spike来促进读取多样性，对文库进行测序。

生物信息学扩增子序列分析

使用描述的方法分析16S rRNA（V3和V4）扩增子序列数据。使用FastQC和eestats2评估序列质量。通过质量阈值的序列使用DADA2流程进行修剪和扩增子序列变异（Amplicon Sequence Variants, ASVs）分配。使用R “decontam”包识别并去除与阴性对照样本和潜在污染物相关的ASV，以及叶绿体或线粒体相关类群。

数据分析与统计

所有16S rRNA扩增子测序数据均在RStudio中使用描述的方法进行分析。使用Shapiro-Wilk检验确定暴露处理组肺部微生物组的Shannon-Wiener多样性（Shannon-Wiener Diversity）和分类群丰富度（Taxa Richness）的正态分布。由于Shannon-Wiener多样性（P < 0.001）和分类群丰富度（P < 0.001）不呈正态分布，我们使用Kruskal-Wallis检验比较暴露处理组之间Shannon-Wiener多样性和分类群丰富度的均值方差。如果Shannon-Wiener多样性或分类群丰富度的均值在组间存在显著差异（α = 0.05），我们则进行Dunn检验以确定哪些暴露处理组对在Shannon-Wiener多样性或分类群丰富度上存在差异。

使用R “vegan”包进行β多样性（Beta Diversity）分析。数据通过“decostand”函数进行中心对数比（Center-Log Ratio）转换，并在Aitchison距离上执行主坐标分析（Principal Coordinate Analysis, PCoA）并可视化。在运行成对比较之前，使用“betadisper”评估方差的同质性。在确保组间离散度没有显著差异后，使用“adonis2”执行置换多元方差分析（Permutational Multivariate Analysis of Variance, PERMANOVA），并使用“pairwiseAdonis”阐明单对比较。

结果

宿主炎症反应、肺部微生物组组成与粉尘暴露

我们发现，与同时期的环境空气对照组相比，暴露于环境粉尘会引发小鼠肺部显著的中性粒细胞炎症（Neutrophilic Inflammation）。使用针对非正态分布数据的Kruskal-Wallis检验，我们发现平均中性粒细胞募集（占CD45+细胞的百分比）在处理组之间存在显著差异（P = 0.004）。Wilcoxon检验证实，暴露于PD2021粉尘（P = 0.029）和WI2020粉尘（P = 0.029）的小鼠中性粒细胞百分比显著增加，暴露于WI2021粉尘的动物中性粒细胞募集略有显著增加（P = 0.057）。对于暴露于WI2020粉尘的小鼠，平均中性粒细胞募集显著高于暴露于PD2021粉尘（P = 0.029）或WI2021粉尘（P = 0.029）的小鼠，表明2020年秋季在威斯特地点（靠近索尔顿海，WI2020）收集的粉尘引发了更高程度的中性粒细胞肺部炎症。相比之下，在粉尘暴露组与其同时期对照组之间未观察到嗜酸性粒细胞（Eosinophil）募集的显著差异。

就宿主中性粒细胞募集而言，暴露于对照空气的小鼠被认为是健康的，并用于表征共享环境中的基线肺部微生物组。使用Aitchison距离矩阵，我们通过PCoA可视化不同处理组（如暴露处理）肺部微生物群落组成的差异。暴露于PD2021、WI2020和WI2021粉尘的小鼠的肺部微生物组比暴露于对照空气的小鼠具有更大的离散度。此外，暴露于PD2021粉尘的小鼠的肺部微生物组与暴露于环境空气的小鼠紧密聚类，而暴露于WI2020和WI2021粉尘的小鼠的微生物组则远离该组且彼此分离。PERMANOVA显示，暴露处理组之间的肺部微生物组群落组成存在显著差异（P < 0.001）。具体而言，暴露于WI2021粉尘显著改变了肺部微生物组组成，与其同时期对照空气微生物组相比（P = 0.002）。虽然暴露于PD2021粉尘与其同时期对照组相比并未显著改变肺部微生物组组成（P = 0.630），但PD暴露粉尘肺部微生物组的组成与WI2020粉尘（P = 0.003）和WI2021粉尘（P = 0.002）微生物组存在显著差异。同样，WI2020暴露组的肺部微生物组组成与WI2021暴露组相关的肺部微生物组存在显著差异（P = 0.002）。

基线肺部微生物多样性与粉尘暴露

我们计算了肺部微生物群落的分类群丰富度和Shannon-Wiener多样性，并使用Kruskal-Wallis检验确定处理组之间的差异。分类群丰富度在组间没有显著差异（P = 0.26）。同样，与其同时期环境空气对照相比，粉尘暴露的肺部微生物组的Shannon-Wiener多样性没有显著差异（PD2021 P = 0.95，WI2020 P = 0.078，WI2021 P = 0.23）。当比较粉尘暴露组之间的Shannon-Wiener多样性时，WI2020暴露小鼠的肺部微生物组多样性与PD2021暴露小鼠没有显著差异（P = 0.21）。相比之下，WI2020和WI2021暴露小鼠之间的Shannon-Wiener多样性存在显著差异（P < 0.001），这显然是由于这两个威斯特粉尘暴露组之间的均匀度（Evenness）变异性所致。

我们使用核心微生物组（Core Microbiome）分析以最低1%相对丰度（Relative Abundance, RA）的阈值可视化每个处理组的均匀度和分类群流行度。根据暴露材料，组间的分类群均匀度存在显著差异（P < 0.01），WI2021暴露的肺部微生物组的均匀度显著低于对照空气微生物组（P = 0.016）和WI2020暴露的肺部微生物组（P = 0.019）。当比较对照空气和粉尘暴露小鼠的肺部微生物组分类群丰度时，WI2020组显示出更高的分类群丰度，有更多或不同的分类群在1% RA下独特存在或更普遍。这些分类群包括无色杆菌属（Achromobacter）、异地球菌属（Atopostipes）、水杆菌属（Enhydrobacter）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、甲基红球菌属（Methylorubrum）和微杆菌属（Microbacterium）。相比之下，有两个分类群，类节杆菌属（Paenarthrobacter）和葡萄球菌属（Staphylococcus），在75-100%的WI2021肺部微生物组样本中普遍存在。此外，WI2021暴露组在核心分类群中显示出较低的丰度，大多数分类群在约25%的采样肺部中普遍存在。

我们使用PERMANOVA评估慢性粉尘暴露后肺部微生物组反应的差异是否可归因于小鼠性别或肺叶部分（左叶与右叶）。我们没有检测到任何由于性别或肺叶引起的影响。仅在暴露于对照空气的小鼠中，基线肺部微生物组组成的显著差异未归因于性别（P = 0.567）或肺叶部分（P = 0.721）。类似地，仅在粉尘暴露的小鼠中，未检测到性别（P = 0.848）或肺叶部分（P = 0.906）之间肺部微生物组组成的显著差异。

讨论

本研究显示，肺部微生物群落组成因粉尘暴露而异。与暴露于环境过滤空气的小鼠相比，在粉尘暴露的小鼠肺部发现中性粒细胞募集更高。我们在本研究中使用的老鼠中表征了一个基线肺部微生物组。然而，这里描述的具体微生物组并不能广泛指示超出本研究范围的宿主肺部健康或炎症状态。虽然未检测到小鼠性别或肺叶对肺部微生物群落的差异，但核心肺部微生物组的多样性和组成受到粉尘来源和暴露的影响。事实上，暴露于威斯特地点收集的粉尘（该粉尘引发了 heightened 的中性粒细胞免疫反应）的小鼠，其肺部微生物组具有更高的β和α多样性以及均匀度，而暴露于引发较少中性粒细胞募集的威斯特粉尘的小鼠则不然。同样，来自威斯特的粉尘对粉尘微生物组成施加影响，并改变了流行分类群的相对丰度。暴露于来自距离索尔顿海较远的棕榈沙漠的粉尘的小鼠肺部，与暴露于环境对照空气的肺部更为相似。相反，暴露于2021年在索尔顿海附近威斯特地点收集的粉尘，产生的肺部微生物组与暴露于环境空气的肺部聚类更远。

对照组和暴露组之间的中性粒细胞募集存在差异，这表明慢性粉尘暴露确实会引发中性粒细胞炎症；然而，该炎症的强度与肺部微生物组多样性和组成的变化不一致。这表明宿主肺部微生物组正在直接响应粉尘暴露，而不是肺部炎症的生理效应。目前尚不清楚疾病期间肺部结构的改变是否驱动肺部微生物菌群失调，或者菌群失调是否引发炎症。先前的研究表明，肺部微生物组谱及其与宿主免疫反应的关系取决于内型（Endotype）。一项研究观察到2型哮喘（Type 2 Asthma）炎症标志物与肺部微生物组组成之间缺乏关系，但接着提出肺部微生物组菌群失调在患有严重的非2型哮喘（以中性粒细胞为主导的炎症为特征）的患者中可能高度相关，类似于我们在本研究中观察到的现象。此外，另一项研究观察到，在以混合性（中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）或中性粒细胞为主导的内型的哮喘患者痰液样本中，细菌分类群丰富度显著高于以嗜酸性粒细胞为主导和少粒细胞性（Paucigranulocytic）内型。在我们的研究中，与同时期的环境空气对照相比，长期暴露于非生物性粉尘材料会导致显著的中性粒细胞为主导的炎症。参考在肺部微生物组组成中观察到的显著变化，我们的研究结果表明，慢性暴露导致的粉尘诱导的肺部微生物组菌群失调可能正在驱动中性粒细胞募集，从而引发显著的肺部炎症。

宿主炎症反应和肺部微生物组组成受到慢性粉尘暴露的独立影响。先前的研究表明，低微生物多样性与肺功能差相关。同样，哮喘儿童的肺部微生物组可能与健康儿童的肺部组成不同，这可能与疾病严重程度或医疗干预类型有关。我们的研究发现，虽然慢性粉尘暴露改变了肺部微生物组多样性，但这种改变是独立于宿主肺部炎症状态发生的。

尽管微生物分类群丰富度没有变化，但暴露于威斯特粉尘的慢性暴露改变了基线肺部微生物组多样性。暴露于2020年收集的威斯特粉尘的小鼠肺部与暴露于棕榈沙漠（2021年）粉尘的小鼠肺部一样多样化。然而，暴露于2021年威斯特粉尘的小鼠肺部超过了其他处理组的微生物多样性水平。鉴于沙尘暴会携带微生物残留物、化学成分和颗粒物，这些物质可能导致宿主对该粉尘的反应，这些物质的存在或流行度很可能改变了肺部微生物组中发现的分类群的相对丰度。先前的研究表明，暴露于颗粒物、粉尘、烟雾或臭氧可能导致肺部微生物菌群失调，这可能与哮喘炎症或其他呼吸系统病理有关。然而，这些研究中的许多数据是相关性的，并且容易引发更多问题，即这些物质是直接改变肺部微生物组，还是暴露于这些类型的残留物或物质后造成的肺损伤间接改变了呼吸生态系统。我们的研究显示，暴露于2020年威斯特粉尘的小鼠肺部比暴露于其他粉尘来源或日期的小鼠肺部具有更高的均匀度，这导致了在这些肺部微生物组中检测到的多样性增加。

我们在暴露于2021年收集的威斯特粉尘的肺部中检测到革兰氏阳性菌（Paenarthrobacter和Staphylococcus）的流行度更高，这些细菌在该处理组的动物中普遍存在，并与较低的中性粒细胞募集相关。相比之下，暴露于2020年威斯特粉尘的肺部比暴露于WI2021粉尘的肺部具有更高的中性粒细胞募集和更多的革兰氏阴性假单胞菌属（Pseudomonas spp.）。与我们发现富含假单胞菌的肺部具有高微生物多样性的结果相反，先前关于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的研究发现假单胞菌与肺部微生物多样性降低相关。假单胞菌通常在被发现于患有严重哮喘炎症的患者的肺部，然而在正常健康肺部中几乎检测不到假单胞菌。其他研究表明，中性粒细胞募集和宿主炎症反应通常可能与革兰氏阴性菌（如假单胞菌）有关，这些细菌富含脂多糖（Lipopolysaccharides）并介导中性粒细胞活化。同样，我们的研究结果显示，在暴露于WI2020粉尘的肺部微生物群落中，革兰氏阴性分类群比在WI2021暴露的肺部中更普遍。虽然不同的疾病，包括哮喘，可能改变肺部微生物组的结构和功能，但其他人口统计学特征（如年龄和性别）可能决定索尔顿海地区暴露的居民是否易患心肺或神经系统疾病。我们的研究表明，暴露于粉尘可能影响易感人群的肺部微生物组结构。

总体而言，我们的研究结果表明，环境粉尘暴露改变了肺部微生物群落。鉴于索尔顿海粉尘排放的预测增加，被夹带的粉尘可能将污染物、矿物质和其他潜在毒素引入大气。这些不断变化的条件也可能影响源自干涸的索尔顿海湖床的风成微生物群落的地理分布和功能能力。然而，我们的研究使用了过滤的、非生物性的粉尘材料，因此并不代表索尔顿海风成微生物组对宿主肺部微生物组组成的直接影响。总之，当地粉尘排放中的微生物残留物和化学成分，以及矿物和有机颗粒物，可能会加剧粉尘暴露风险，并对生态系统稳定性、保护和公共健康产生影响。