利用基于双足DNA行走器的比率荧光传感器，在细胞中对microRNA-21进行高度敏感和定量的检测

《Analytical Chemistry》：Highly Sensitive and Quantitative Detection of microRNA-21 in Cells Using Bipedal DNA Walker-Based Ratiometric Fluorescent Sensor

　　精准检测低丰度miRNA-21的对称双足DNA漫步器传感器研究。通过构建双信号比率荧光检测系统，利用动态同步的内部参考信号消除环境干扰，实现miR-21的高灵敏度（LOD 2.20 pM）和稳定定量。金纳米颗粒负载的DNA漫步器在细胞内展现出优异的空间分辨成像能力，可区分不同癌细胞的miR-21表达水平（550 pM, 300 pM, 26 pM）。该策略突破传统单信号检测局限，通过ratiometric分析同步校正纳米颗粒负载、链组装及环境波动（pH、离子浓度、温度）引起的信号偏移，为复杂生物环境中的肿瘤标志物检测提供新范式。

　　这项研究提出了一种基于对称双足DNA步行器（BDW）的比率荧光传感器，用于高灵敏度、高精度地检测低丰度的微小RNA（miRNA），特别是miR-21在细胞内的表达。miRNA作为肿瘤标志物，在肿瘤的发生、发展、转移和侵袭过程中起着关键作用。然而，传统方法在检测这类低丰度miRNA时面临诸多挑战，如信号波动、低信噪比、灵敏度不足以及假阳性和假阴性等问题。尤其是在复杂生物环境中，这些干扰因素可能显著影响检测的准确性和重复性。因此，开发一种能够有效克服这些限制的新型检测平台，成为推动癌症诊断和治疗监测的重要方向。

DNA步行器是一种利用DNA自组装和动态行为构建的纳米机器，其通过目标分子的识别触发多步行走，从而实现信号的放大。然而，传统DNA步行器通常采用单一荧光标记的方式，这种单通道设计在面对环境变化时容易导致信号不稳定，且难以有效区分背景噪声和真实信号。此外，细胞微环境中的波动，如离子浓度、酶活性、温度和pH值的变化，都会影响DNA步行器的运行效率，进而降低检测的可靠性。为了提升检测精度，研究人员设计了一种对称结构的双步DNA步行器，其中一条腿用于生成检测信号，而另一条腿则同步放大一个动态的内部参考信号。这一设计不同于传统的静态内部参考策略，而是引入了一个实时同步的内部参考机制，以确保检测信号与参考信号在相同条件下变化一致，从而有效消除环境因素对检测结果的干扰。

在实验过程中，研究人员采用金纳米颗粒（Au NPs）作为载体，通过一种优化的构建方法将倒置发夹结构的DNA（IH-DNA）和行走支架结合。这种方法不仅提高了信号的稳定性，还增强了传感器的灵敏度和选择性。具体而言，IH-DNA被修饰为带有Cy5荧光标记的3′端和FAM荧光标记的5′端，并且中间含有二硫键，使其能够形成倒置发夹结构，从而在DNA步行过程中实现两个不同的信号路径。同时，双足结构中每条腿都包含10-23 DNA酶，确保了信号的同步放大，从而提高了检测的可靠性和准确性。

为了验证传感器的性能，研究人员在不同浓度的miR-21条件下进行了检测实验。实验结果表明，Cy5信号在仅存在辅助序列（AS）的情况下被激活，而FAM信号则在miR-21存在时被触发。两者的信号强度变化趋势相似，且在不同浓度下表现出良好的线性关系。通过引入过量的AS，可以解锁所有行走支架的3′端，从而生成一个稳定的Cy5信号作为内部参考。这种调整使得FAM/Cy5的比率与miR-21的浓度之间建立了更精确的线性关系，从而显著提高了检测的灵敏度和准确性。

此外，研究人员还评估了该传感器在不同环境条件下的稳定性。在镁离子浓度和反应时间变化的情况下，传感器的比率信号仍保持稳定，表明其对环境扰动具有较强的鲁棒性。同时，通过三维荧光成像技术，研究人员能够观察到miR-21在不同细胞类型中的空间分布情况，如MCF-7、HeLa和HEK293细胞。结果表明，miR-21在癌细胞中的表达水平较高，而在正常细胞中的表达较低，这一趋势与之前的文献报道一致。同时，空间异质性可能反映了miR-21在细胞内的不同定位及其生物学功能，为深入理解miRNA在疾病中的作用提供了新的视角。

为了进一步验证该传感器的适用性，研究人员采用了一系列优化的实验条件，包括不同浓度的BDW和过量的AS，以确保检测的准确性和可重复性。通过提取图像中的像素级荧光强度，研究人员计算了每个像素的平均荧光强度和FAM/Cy5比率，并将其与miR-21的浓度建立线性关系。这种比率荧光成像方法不仅提高了检测的直观性，还使得不同细胞类型之间的miR-21表达差异更加清晰可见。最终，研究人员构建了一个统一的标准曲线，用于定量分析不同细胞类型中的miR-21浓度，并通过调整测量时间，进一步优化了信号的同步性和准确性。

该研究提出的方法为肿瘤标志物miR-21的检测提供了一种可靠、高效的平台，尤其是在复杂生物环境中。通过引入动态内部参考信号，研究人员成功克服了传统方法在环境干扰下的局限性，提高了检测的稳定性和准确性。同时，该传感器的结构设计和信号同步机制，使其能够在活细胞中实现高灵敏度的miRNA检测，并为未来癌症诊断和治疗监测提供了重要的技术支持。此外，该研究还揭示了miRNA在细胞内的空间分布可能与其生物学功能密切相关，为进一步研究miRNA在疾病中的作用提供了新的思路。