臭氧暴露通过干扰红细胞的免疫-炎症稳态机制导致贫血

《Environment & Health》：Ozone Exposure Induces Anemia via Immune-Inflammatory Disruption of Erythroid Homeostasis

　　臭氧暴露通过免疫炎症轴调控Jund-Ccl5-Lck-Ifng网络导致小鼠贫血机制研究。

　　地面臭氧（O?）作为一种重要的环境空气污染物，已被流行病学研究与贫血建立联系，但其作用机制尚不明确。本研究通过整合表型、组织病理学和转录组分析，深入探讨了O?诱导贫血的分子机制。实验中，使用C57BL/6J小鼠作为模型，进行了为期28天的全身性O?暴露，暴露浓度为0.25 ppm和0.50 ppm（每日4小时），同时设置清洁空气对照组。结果显示，只有在0.50 ppm暴露条件下，才观察到显著的血液学变化，包括红细胞参数（红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积和网织红细胞）的下降，以及系统性免疫炎症反应的激活（淋巴细胞计数增加）。此外，O?暴露还导致造血损伤，表现为祖细胞分化能力受损（CFU-GEMM集落形成能力下降20.55%，p < 0.05），骨髓造血细胞减少，以及脾脏中出现髓外造血现象。通过转录组分析，识别出30个与免疫炎症相关的差异表达基因（IR-DEGs）。结合蛋白质-蛋白质相互作用拓扑结构和转录调控网络的层次分析，揭示了一个核心调控轴，包含转录因子和7个枢纽基因。定量实时PCR（qRT-PCR）和蛋白质检测进一步表明，Jund是该调控网络中的关键节点，调控重要的免疫炎症相关基因（如Ccl5、Lck和Ifng）。这些发现表明，Jund作为免疫炎症过程中的关键转录因子，介导了O?诱导的红细胞稳态破坏，为环境性贫血的预防提供了实验依据。

### 一、引言

近年来，地面臭氧已成为全球环境健康的重要威胁。监测数据显示，大气中O?浓度持续上升，全球超过40%的城市暴露在有害的O?浓度范围内，其中大部分位于中国和印度。这一趋势导致了全球范围内与O?相关疾病的发病率和死亡率的增加，每年约有42万例因O?暴露而提前死亡。预测显示，未来O?相关死亡率仍将继续上升。除了死亡率，已有研究表明，O?暴露与呼吸系统、代谢系统以及多器官功能障碍等不良健康结果相关。然而，关于O?对造血系统的影响研究仍较为有限。

造血过程是调控血液细胞生成的动态机制，对氧气运输、免疫功能和凝血-抗凝血平衡至关重要。由于其核心功能，造血系统的紊乱，无论是通过遗传损伤、化学毒素还是环境污染物，都可能导致造血损伤及相关的病理变化。越来越多的证据表明，O?是一种重要的环境性造血应激因子，与动物模型和流行病学研究中异常红细胞生成及贫血的发生密切相关。例如，动物实验发现，O?暴露可能通过与内毒素的相互作用加剧或诱发炎症性贫血。纵向队列分析则表明，每年每增加0.01 ppm的O?暴露，贫血风险增加8%（OR = 1.08，95% CI: 1.07–1.09）。然而，这些研究结果也存在一定的不一致性。在中国的横断面分析中，并未发现O?暴露与贫血之间的显著关联，而在高海拔地区则观察到O?诱导的代偿性红细胞增多。这种不一致性凸显了开展系统研究以探索大气O?暴露与贫血之间的潜在关联，并揭示其分子机制的重要性。

免疫炎症信号通路被认为是污染物诱导造血损伤的一个关键机制。促炎性细胞因子（如IFN-γ、TNF-α）通过抑制髓系红细胞祖细胞的分化，驱动慢性炎症相关性贫血。此外，大气细颗粒物（PM?.?）和氮氧化物（NO?）暴露已被证明可通过免疫炎症通路导致血红蛋白减少。鉴于O?吸入能够强烈触发全身性炎症反应，其特征包括剂量依赖性的细胞因子释放和Toll样受体4（TLR4）信号通路的激活，因此类似的炎症机制可能在O?诱导的造血稳态破坏中发挥作用，并可能参与贫血的发生。然而，目前尚缺乏直接的实验证据，证明O?诱导的免疫炎症反应与贫血的发生之间存在因果关系。

本研究建立了一个O?暴露动物模型，以明确O?暴露是否会导致贫血，并在导致贫血的前提下进一步揭示其潜在机制。研究结果将为探索O?暴露对贫血的有害影响提供有价值的参考。

### 二、材料与方法

#### 2.1 动物与O?暴露

选取7至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠，购自Vital River实验室动物技术有限公司（北京）。在标准饲养条件下适应一周后，小鼠被随机分为三组：对照组（清洁空气，0.00 ppm）、0.25 ppm组（O?暴露浓度为0.25 ppm，每日4小时）和0.50 ppm组（O?暴露浓度为0.50 ppm，每日4小时）。根据中国过去十年的生态环境报告，中国主要城市每日最大8小时平均O?浓度的第90百分位为0.07–0.08 ppm，接近许多国家的环境标准限值。最高年平均浓度可达到0.15 ppm。考虑到小鼠对O?的耐受剂量是人类的三倍，0.25 ppm和0.50 ppm被用于小鼠实验以模拟实际环境中的O?暴露。

为了建立一个稳定且便于操作的O?暴露系统，O?生成器将空气泵引入的清洁空气转化为O?，并直接输送到封闭暴露室（SEC）。SEC中的O?浓度通过O?监测仪（Models 106-L，2B Technologies）实时监测，并通过流量调节器调整吸入气流。在整个暴露过程中，0.25 ppm组的平均O?浓度为0.251 ± 0.021 ppm，0.50 ppm组的平均O?浓度为0.507 ± 0.044 ppm（见图S1）。

每周测量小鼠体重，以监测体重变化。在O?暴露结束后，采集外周血、骨髓和脾脏样本。所有实验方案均经山西大学科研委员会批准。暴露后，每组选取9只小鼠进行血液参数评估，其余小鼠被处死以采集脾脏和股骨样本，其中3只用于组织病理学分析，3只用于转录组分析，6只用于集落形成实验，8只用于酶联免疫吸附测定（ELISA）和qRT-PCR分析（见图S2）。

#### 2.2 血液参数与细胞形态学分析

外周血样本采集后，使用含EDTA-K?的抗凝管保存。血液参数分析采用Mindray BC-60R Vet（型号BC-5000vet，深圳，中国）。分析包括以下三个方面：（1）白细胞参数：总白细胞（WBC）、淋巴细胞（Lym）、中性粒细胞（Neu）和单核细胞（Mon）；（2）红细胞参数：红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）和标准差（RDW-SD）；（3）血小板计数（PLT）。细胞形态学分析采用Wright-Giemsa染色法（Solarbio，北京）对外周血涂片进行染色。网织红细胞（Ret）计数使用亮蓝染色法（Solarbio，北京）在油镜下进行，每份样本手动计数≥1000个红细胞以确定网织红细胞百分比（Ret %）。

#### 2.3 组织病理学检查

采集股骨和脾脏样本后，使用4%中性多聚甲醛在室温下固定过夜。随后，股骨经脱钙处理并嵌入石蜡，组织切片后使用苏木精和伊红（H&E）染色。脾脏的处理与股骨类似，但无需脱钙。组织病理学改变通过标准显微镜（AXIO Zoom.V16，德国）评估。使用ImageJ软件对每张切片随机选取≥6个视野进行定量分析，并计算平均值作为该切片的结果。

#### 2.4 骨髓细胞集落形成实验

纯化的骨髓有核细胞（BMNCs）以1 × 10?细胞/mL浓度重悬于半固体甲基纤维素培养基（StemCell Technologies，西雅图，美国）中，并加入重组细胞因子（IL-3、SCF、EPO）。细胞悬液通过轻柔颠倒混匀后，置于30 mm培养皿中，并在含5% CO?的恒温培养箱（37°C）中培养。经过12天的培养后，对三个不同的祖细胞群体（BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM）进行计数、识别和分析。骨髓有核细胞的分离与鉴定详细方法见补充材料（见Texts S1）。

#### 2.5 转录组测序分析

骨髓样本（每组3只）来源于随机分组的小鼠，用于转录组分析（见图S5）。使用上海应用蛋白技术有限公司的RNA-seq技术进行分析。差异表达基因（DEGs）的筛选标准为p值<0.5且|Fold Change| >1.5。多维功能分析采用DAVID数据库进行，包括基因本体（GO）富集分析（涉及生物过程、分子功能和细胞成分类别）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。基因集富集分析（GSEA）在生物信息学云平台（见https://www.bioinformatics.com.cn/）上进行。通路的富集分析以绝对值的标准化富集分数（NES）>1.5且FDR < 0.05为显著标准。通过ImmuCellAI平台（见https://guolab.wchscu.cn/ImmuCellAI/#!/）生成小鼠骨髓中免疫细胞组成的全面图谱。

#### 2.6 免疫相关DEGs筛选

从免疫学数据库和分析门户（ImmPort，见https://www.immport.org）中获取包含2483个注释基因的免疫相关基因数据集。基于Ensembl基因ID进行去重后，使用biomaRt（v2.50.3）在R（v4.2.1）中将小鼠同源基因映射到对应的基因。跨物种翻译后得到1202个保守的免疫基因。随后整合分析DEGs，识别出50个免疫相关DEGs（IR-DEGs）。

#### 2.7 枢纽基因筛选与转录因子预测

候选通路相关基因通过STRING数据库进行系统性蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。生成的PPI网络导入Cytoscape进行图论分析。枢纽基因通过度中心性排名（前20%节点）进行识别。枢纽基因导入NetworkAnalyst平台（见https://www.networkanalyst.ca）进行潜在上游转录因子（TFs）的预测。

#### 2.8 定量实时PCR

骨髓来源的总RNA使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取，并通过Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）进行纯度检测。第一链cDNA合成使用PrimeScript RT Master Mix试剂盒（TaKaRa公司）进行。SYBR Green基的qPCR实验在QuantStudio实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上进行。目标基因表达以对照组为基准，使用2?ΔΔCt方法进行标准化，β-actin作为参考基因。所有引物对见表S2。

#### 2.9 酶联免疫吸附测定（ELISA）

根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（Aimeng Youning，上海）获取骨髓细胞测试样本和血清样本，并测量Jund原癌基因、AP-1转录因子亚基（Jund）、C-C趋化因子配体5（Ccl5）、淋巴细胞特异性蛋白-酪氨酸激酶（Lck）和干扰素γ（IFN-γ）的水平。骨髓细胞样本通过其蛋白进行标准化。

#### 2.10 统计分析

数据使用SPSS 23.0进行分析，所有数据以均值±标准差（SD）表示。对于体重变化，采用双因素方差分析（ANOVA）并结合Bonferroni事后检验进行成对比较；对于其他数据，采用单因素方差分析（ANOVA）比较各组之间的差异。当方差齐性满足时，选择Fisher最小显著差（LSD）检验进行事后分析；当方差不齐时，采用Dunnett’s T3检验进行多重比较。差异在p < 0.05时被认为具有统计学意义。可视化使用GraphPad Prism 9进行。

### 三、结果

#### 3.1 O?暴露对造血器官及外周血细胞的影响

为了研究O?暴露对造血系统的影响，建立了小鼠全身性O?暴露模型。结果显示，0.25 ppm和0.50 ppm组的小鼠与对照组相比表现出体重下降，但组间差异不显著（见图1A）。进一步分析了脾脏与体重比和骨髓有核细胞计数（见图1B–C）。值得注意的是，O?暴露导致脾脏与体重比呈剂量依赖性增加，0.50 ppm组的脾脏与体重比比对照组增加了1.13倍（p < 0.05），而0.25 ppm组的脾脏与体重比增加了1.02倍（p > 0.05）。此外，骨髓有核细胞计数在0.50 ppm组中显著减少，比对照组减少了13.91%。

外周血、骨髓和脾脏样本的组织病理学检查揭示了O?暴露对造血系统结构的显著改变（见图3A–F）。骨髓中的有核细胞密度显著下降（见图1C）。病理切片显示，随着O?暴露浓度的增加，髓系造血细胞逐渐变得稀疏、无序和分散，同时其分布区域减少，而细胞空间扩大并伴随脂质沉积的增加。此外，巨核细胞数量增加，与定量评估结果一致（见图3B、C）。对于脾脏，0.50 ppm组的白髓结构不规则，白髓与红髓边界逐渐模糊。定量分析显示红髓面积增加，而白髓面积减少，导致红髓与白髓面积比升高（见图3E–F）。这些脾脏变化高度提示了髓外造血，这是骨髓功能受损的代偿反应。综上所述，这些发现表明O?暴露诱导了骨髓和脾脏的结构改变，为O?诱导贫血提供了直接的形态学证据。然而，其潜在的分子机制仍需进一步探索。

#### 3.2 O?暴露对网织红细胞及骨髓细胞集落形成能力的影响

网织红细胞的定量是评估骨髓红细胞系功能的关键指标。结果显示，O?暴露导致网织红细胞成熟动力学的浓度依赖性变化，其中0.50 ppm组的变化最为显著。与对照组相比，0.50 ppm组的相对网织红细胞计数减少了6.55%，绝对网织红细胞计数减少了8.89%（p < 0.05），表明红细胞终末分化受到干扰。进一步的骨髓造血干细胞功能评估显示，O?暴露导致不同祖细胞群体的特定反应（见图2D–H）。具体而言，BFU-E表现出轻微的增殖；CFU-GM逐步减少（0.50 ppm组减少21.31%，p < 0.05）；CFU-GEMM显著减少（0.50 ppm组减少20.55%，p < 0.05）；总集落形成能力减少15.02%（0.50 ppm组，p < 0.05）。这些结果表明不同造血腔室对O?暴露的敏感性存在差异。

#### 3.3 O?暴露对造血系统病理变化的影响

接下来，对造血系统的病理变化进行了系统分析。结果显示，O?暴露导致骨髓和脾脏中不同的浓度依赖性变化（见图3A–F）。骨髓中的有核细胞密度显著下降，而脾脏中的结构发生紊乱。定量分析显示，骨髓造血区域减少，脾脏中红髓面积增加，白髓面积减少，红髓与白髓面积比升高，表明脾脏中的髓外造血。这些组织层面的变化为贫血的病理发生提供了解释。综上所述，造血过程的多层面破坏可能与O?诱导的小鼠贫血密切相关。

#### 3.4 O?暴露对贫血相关转錄變化的影响

骨髓是成人主要的造血器官，通过转录组分析，研究了O?暴露对贫血相关基因表达的影响。结果显示，0.50 ppm组中，有564个差异表达基因（DEGs），其中313个基因上调，251个基因下调（见图4A）。基因集富集分析（GSEA）显示，与对照组相比，基因在T细胞分化（mmu04658）、Th17细胞分化（mmu04659）和抗原加工与呈递（mmu04612）等关键通路中显著富集（见图4B）。此外，免疫细胞浸润分析显示，骨髓中免疫细胞的比例没有显著变化（见图4C）。然而，功能激活表明T细胞通路富集。

#### 3.5 免疫相关DEGs的识别

进一步分析了O?暴露诱导的免疫炎症网络中的差异表达基因。结果识别出50个免疫相关DEGs（IR-DEGs），其中45个基因上调，5个基因下调（见图5A）。通过PPI网络和度中心性分析，识别出7个枢纽基因（Ctla4、Cd247、Ifng、Cd3e、Lck、Cd3g和Ccl5）（见图5E）。

#### 3.6 转录因子的预测

随后，对IR-DEGs的上游转录因子（TFs）进行了预测。NetworkAnalyst分析识别出22个进化保守的TFs，具有广泛的调控潜力，但仅有6个转录因子影响超过3个IR-DEGs，包括Chd1、Jun、Tcf12、Nxi1、Nrf1和Jund。为了验证转录组分析结果，使用qRT-PCR对枢纽基因的表达模式进行了验证。定量分析显示，Jund（1.15倍，p = 0.008）、Ccl5（1.12倍，p = 0.005）、Ifng（1.26倍，p = 0.045）和Lck（1.20倍，p = 0.033）在O?暴露后显著上调，而其他基因的表达变化不显著（p > 0.05）（见图6B）。枢纽基因（Ctla4、Cd247、Ifng、Cd3e、Lck、Cd3g和Ccl5）以及转录因子Jund的表达模式与RNA-seq数据一致（见图6B、C）。为了进一步探讨这些基因与表型数据之间的关系，进行了Spearman相关性分析。结果表明，Jund与红细胞参数（RBC、HGB、HCT）和网织红细胞计数呈显著负相关（p < 0.05），而与淋巴细胞计数呈显著正相关（p < 0.05）。Ccl5的表达与淋巴细胞数量呈相关趋势，表明淋巴细胞与Ccl5之间存在协同作用。Lck促进辅助T细胞分化和IFN-γ分泌。IFN-γ作为主要的炎症细胞因子，直接抑制红细胞集落形成，导致红细胞减少，并重新编程造血干细胞的转录谱。这些发现与已知的机制一致，例如汞暴露通过Ifng抑制造血干细胞增殖，以及结核杆菌感染通过Ifng缩短红细胞寿命。值得注意的是，我们验证了这些基因在mRNA和蛋白水平上的协同上调，进一步支持其在O?诱导的造血毒性中的作用。

### 四、讨论

已有研究表明，大气O?与贫血之间可能存在关联，但结果存在争议。为了填补这一知识空白，我们采用动物暴露模型提供了更明确的证据。28天的O?（0.50 ppm）暴露后，观察到红细胞参数（RBC、HGB、HCT）的显著下降，以及造血祖细胞分化障碍，这可能促进贫血的发生。同时，淋巴细胞数量的增加表明O?激活了免疫系统。从机制上看，转录组分析显示，Jund作为关键的转录因子，调控多个免疫炎症相关差异表达基因（如Ifng、Lck和Ccl5）。这些发现不仅为O?诱导的造血损伤提供了理论依据，也为环境暴露相关的血液系统疾病靶向预防提供了实验支持。

在探讨O?暴露对造血系统的影响时，发现其主要表现为外周血细胞系（包括白细胞、红细胞和巨核细胞）的定量异常。虽然在实验组中未观察到明显的细胞形态学异常（见图1D），但定量分析表明，O?暴露可导致红细胞参数的浓度依赖性下降，同时未观察到明显的红细胞形态学适应。这一发现与之前动物模型和流行病学研究的证据一致。相比之下，其他研究报道O?暴露可引起红细胞参数的短暂升高，但差异可能源于特定人群的生理适应，例如高海拔居民在慢性缺氧条件下可能维持氧气饱和度。此外，暴露模型的不同也可能导致结果的差异，即我们的研究采用的是正常小鼠的长期暴露，而非专门模型。网织红细胞动力学是评估骨髓造血活性和红细胞生成的敏感指标。我们的研究结果表明，O?暴露后相对和绝对网织红细胞计数均显著下降，这与之前的研究结果一致，证实了O?暴露可导致红细胞生成的受损。新兴证据表明，免疫介导的炎症反应是环境暴露诱导造血损伤的关键机制。此前的单细胞转录组研究显示，苯可通过免疫相关基因网络诱导造血干细胞毒性。在本研究中，识别出30个核心的免疫炎症网络差异表达基因。这些发现与我们之前对NO?/PM?.?暴露的研究一致，表明免疫炎症在造血调节中的作用，但同时也揭示了污染物特异性的改变模式。这些差异可能源于不同污染物的化学特性、其在造血系统中的分子靶点异质性，以及不同暴露参数下的调控效应。

Jund作为AP-1转录因子家族成员，是免疫炎症过程中的关键调控因子，调控多个枢纽基因，包括Ccl5、Lck和Ifng。已有研究证实，Jund在调控造血细胞系分化中起着重要作用。这一特性也解释了本研究中观察到的Jund转录水平的“适度变化”却产生显著的功能效应，表明其作用不依赖于单基因水平的剧烈变化，而是依赖于下游基因网络的协调相互作用。具体而言，多个Jund下游的枢纽基因通过多维机制破坏造血稳态，最终导致贫血。其中，Ccl5作为调控免疫细胞招募和造血微环境稳态的关键因子，在贫血患者的骨髓和外周血中显著上调。在炎症背景下，Ccl5破坏微环境稳定，使造血偏向于巨核细胞-红细胞祖细胞。本研究还揭示了Ccl5表达与淋巴细胞数量之间的强相关性，表明淋巴细胞与Ccl5之间存在协同作用。Lck促进辅助T细胞分化和IFN-γ分泌。作为核心的炎症细胞因子，IFN-γ直接抑制红细胞集落形成，导致红细胞减少，并重新编程造血干细胞的转录谱。这一发现与已知的机制一致，如汞暴露通过Ifng抑制造血干细胞增殖，以及结核杆菌感染通过Ifng缩短红细胞寿命。值得注意的是，我们验证了这些基因在mRNA和蛋白水平上的协同上调，进一步支持其在O?诱导的造血毒性中的作用。

需要注意的是，本研究仍存在一些局限性。首先，当前的集落形成实验未能评估淋巴系祖细胞（CFU-PreB），限制了对O?对淋巴-髓系分化平衡影响的全面评估。未来的研究应纳入淋巴系特异性集落实验，以全面揭示O?对造血干细胞微环境的影响。此外，未来的工作应建立多种O?暴露模型（如高氧、常氧和低氧），以进一步阐明其对血液氧稳态的影响机制。

### 五、结论

本研究建立了O?暴露动物模型，结合多维度评估，包括外周参数异常、造血干细胞分化障碍、造血组织异质性及转录组测序，系统阐明了O?通过免疫炎症轴诱导小鼠贫血的毒理学机制。这些发现不仅为O?诱导的造血损伤提供了理论依据，也为环境暴露相关的血液系统疾病靶向预防提供了实验支持。