在污染物压力下，为海洋微生物群制定特定地点的水质指导标准

《Environmental Science & Technology》：Defining Site-Specific Water Quality Guidelines for Marine Microbiomes under Contaminant Stress

　　本研究提出整合16S rRNA测序与生态毒理浓度-响应模型的新方法，通过PMA处理区分活菌并计算绝对丰度，首次推导出不同受扰程度海洋生态系统（高生态价值、轻微至中度受扰、高度受扰）的原核生物铜毒性阈值。结果显示高生态价值 sites的微生物对铜更敏感，5%效应浓度（mHC5）分别为0.10、0.85、0.94 μg L?1，验证了需制定针对性的水质标准以保护重要生态系统。

　　海洋生态系统韧性与微生物群落健康密切相关，然而在生态保护管理中，原核生物往往被忽视，主要原因是难以定量定义微生物对污染压力的敏感阈值。本研究引入了一种新颖的方法，结合16S rRNA基因扩增子测序与生态毒理学浓度-响应建模，评估了海洋微生物对污染压力的响应情况，涵盖群落和分类群两个层面。通过使用碘化丙啶单甲基（PMA）区分完整细胞与膜受损细胞，并结合流式细胞术对相对丰度进行归一化处理，可以从中得出个体分类群的无显著效应浓度（NSEC）。这些阈值可以用于构建原核生物的敏感度分布，从而推导出微生物群落的危险浓度（mHCx），用于估计影响微生物群落中x%分类群的污染物浓度。该指标与现有的真核生物数据集和监管框架完全兼容。

在应用该方法到受铜污染的海水微生物群落时，发现高生态价值的微生物群落，如珊瑚礁，相较于受干扰的区域，表现出更高的铜敏感性。铜的微生物群落危险浓度（mHCx）在高生态价值（HEV）区域影响5%分类群的浓度范围为0.10至0.94 μg/L，这突显了对高生态价值区域实施更严格环境保护的必要性。这种定量方法为将特定地点的微生物群落敏感性数据直接整合到环境风险评估中提供了一个稳健的途径。

当前的监测策略主要依赖于生态系统压力的视觉指标，如藻类生长、鱼类和无脊椎动物数量、珊瑚疾病、漂白和组织坏死等。然而，这些指标往往在生态系统显著退化后才显现，从而限制了及时和有效的干预措施。因此，在生态系统早期阶段识别基于微生物的阈值对于有效的珊瑚礁管理至关重要，有助于防止生态系统临界点和相变。解决这一差距需要建立新的方法来量化整个微生物群落的耐受性和敏感性阈值，从而实现更全面的监测和保护高价值生态系统，面对人类活动和气候变化带来的挑战。

水质量指导值（GVs）几乎全部来源于单物种毒性测试，使用真核生物的数据模型为累积物种敏感度分布（SSDs）。然而，为了使管理目标与生态意义和干扰历史一致，高价值生态系统，如原始珊瑚礁微生物群落，可能需要比受干扰区域更严格的特定地点GVs。水质量GVs几乎完全来源于单物种毒性测试，而原核生物很少被纳入考虑。将原核生物纳入SSD框架的主要障碍在于（1）在群落层面测试和建模污染物影响的复杂性；（2）定义与生态相关性相关的群落或分类群层面的终点指标（如群落结构、多样性、功能或代谢）；以及（3）评估绝对（而非相对）变化对存活群落成员的影响。此外，大多数微生物群落压力暴露实验仅限于两到三种处理，这种缺乏统计功效的局限性阻碍了对压力阈值的定量估计。

为了解决这些问题，我们建立了一种预测方法，将微生物群落对污染物的响应转化为特定地点的敏感性阈值，其方法与水质量GVs的推导原则一致。选取了热带海水微生物群落，这些群落位于生态系统干扰梯度的沿线，每个地点均暴露于铜，铜因其生物可利用形式（Cu2?）对水生生物的高度毒性以及在热带海洋环境中频繁检测到而被选为参考毒性物质。通过16S rRNA基因扩增子测序对微生物群落进行定量表征，结合流式细胞术对每个铜浓度下的微生物负荷进行评估，并通过PMA处理排除膜受损细胞的DNA。应用阈值指示分类群分析（TITAN）来识别显著的应力响应指示扩增子序列变异（ASVs），并使用贝叶斯多变量模型对这些ASVs的绝对丰度进行建模，以估计分类群特异性无显著效应浓度（NSECs）。随后，将NSEC值整合到原核生物敏感性分布（PSD）中，从而推导出适用于保护热带珊瑚礁生态系统、轻微至中度干扰和高度干扰环境的特定地点水质量GVs。

研究结果表明，高生态价值的微生物群落对铜的敏感性高于轻微至中度和高度干扰区域。这些结果强调了需要适应本地环境条件和干扰历史的GVs的重要性。我们的方法在推导微生物敏感性阈值方面是首次与建立水质量标准的原则相一致。它还支持一种权衡证据的方法，以开发保护原核生物和真核生物的GVs。研究中使用的微生物群落对铜暴露的敏感性在干扰梯度上表现出显著差异，HEV珊瑚礁的mHC5（细胞数和群落相似度下降5%）阈值比SD–MD和HD区域低4倍以上。这可能是由于各站点地理分离导致的微生物群落结构固有差异，或者由于人类活动和相关的水化学和营养物质差异。例如，近岸站点表现出较高的营养物质浓度，导致微生物丰富度和多样性增加。在HEV站点，寡养型家族Pelagibacteraceae和SAR86，以及异养型家族SAR116和Halieaceae高度丰富。相比之下，近岸站点由Cryomorphaceae、Flavobacteriaceae、Rhodobacteraceae、Cyclobacteriaceae和属于Marinimicrobia门的微生物主导，这些通常与增加的营养物质和退化生态系统有关，包括珊瑚疾病和“微生物化”现象的开始。此外，SD–MD和HD区域的微生物群落可能因长期较高的铜暴露而形成，表现出对污染物的耐受性增加，如海洋生物膜和沉积物中的铜梯度所示。

在之前的微生物群落变化研究中，用于识别微生物群落变化的方法并未确定敏感分类群作为群落比例的阈值，这是从累积敏感度分布中推导水质量GVs所必需的。相比之下，我们估算敏感污染物阈值（NSECs）的方法与GVs推导指南一致。此外，本研究中的NSEC值基于绝对ASV丰度，而不是相对丰度，后者可能会人为夸大或缩小响应，如图1A所示，以及Vandeputte等人的研究。每个分类群的NSEC阈值是基于其自身丰度相对于对照样本的统计显著变化来计算的，无论该分类群在数据集中的稀有程度或丰富度（尽管一些稀有分类群可能因未被TITAN选为可靠指标而被排除）。这样，阈值的检测更多依赖于分类群的响应模式，而不是其在数据集中的相对主导地位。微生物分类群对铜暴露的响应复杂，表现出各种单调和非单调模式，反映了群落对压力暴露的混合反应，包括生存、生长和繁殖的组合。应对这些复杂响应需要采用贝叶斯广义可加模型（GAMs），这种建模方法比典型的S型、对数-逻辑和激素模型更为灵活。结合这些方法，即通过模型拟合复杂响应来估算敏感和显著效应阈值，考虑绝对丰度变化，并应用PMA排除膜受损细胞的DNA，为估算效应阈值提供了变革性的框架，用于在累积敏感度分布中推导危险浓度，符合推导水质量GVs的最佳实践。

从指示ASV的NSEC中生成累积PSD，使得能够推导出对每个微生物群落中x%指示ASV有害的铜浓度（mHCx）。此前的研究通过累积分布生成微生物HCx值：（1）土壤操作分类单元（OTU）的绝对丰度对银硫化物纳米颗粒的EC20值；（2）沉积物OTU的相对丰度对铜污染的EC50值；以及（3）铜暴露海水群落中ASV相对丰度的改变点值（TITAN）。本研究首次基于更敏感的绝对丰度ASV NSEC值生成mHCx值，并评估其在干扰梯度上的一致性。此外，mHCx值包括了在铜梯度上显著减少和增加的ASV，因为微生物变化无论响应方向如何都可能导致不良状态。通过基因组分析可以进一步澄清，受干扰微生物群落的抗性是否源于组成变化、脆弱分类群的丧失，或冗余功能途径的存在，尽管这超出了本研究的范围。此外，将关键功能或代谢途径的阈值整合到功能敏感度分布（FSDs）中，可以提高未来的评估效果，因为某些代谢功能可能与分类群组成脱钩。尽管组学方法提供了前景，但它们尚未与当前的水质量指导标准对齐。解决这些问题将进一步完善该框架，提高其在指导早期干预以保护海洋微生物群落中的应用信心。总之，我们的定量方法标志着环境微生物学和生态毒理学方法的统一，为建立一个适应特定环境压力的稳健监管框架提供了途径。