标准化暴露介质以增强基于斑马鱼胚胎的毒性试验的严谨性和可重复性

《Environmental Science & Technology》：Standardizing Exposure Media to Enhance the Rigor and Reproducibility of Zebrafish Embryo-Based Toxicity Assays

　　斑马鱼胚胎毒性测试中暴露培养基的离子组成差异可能导致实验结果波动。研究表明，TPHP等化学物质引起的胚胎心脏水肿程度与培养基离子强度显著相关，且渗透调节异常可能加剧毒性效应。建议标准化培养基离子成分，并进一步研究胚胎渗透调节机制及表皮损伤的化学作用路径。

　　

斑马鱼胚胎和电鳗胚胎被广泛用于支持大规模的化学毒性筛选、确定需要在哺乳动物身上进行测试的药物和环境化学物质，并开展以假设为导向的研究，以揭示导致不良形态、生理和/或行为表型的机制。因此，美国国内外的先前努力提高了人们对识别基于斑马鱼胚胎的检测方法中潜在的实验室内部和实验室间变异性的认识，并制定了国际统一的指南，以确定化学物质对斑马鱼胚胎阶段的毒性（即OECD测试236：鱼胚胎急性毒性测试）。例如，在美国，国家毒理学计划大约在10年前与学术界、政府和工业界的研究人员协商后，建立了“斑马鱼在毒理学中的应用系统评估”（SEAZIT）项目，以识别和记录依赖斑马鱼胚胎进行化学毒性测试的检测方法中的潜在变异来源。(1) 该项目的初步结果显示，静态暴露与动态更新暴露方式以及是否存在胚膜是两个主要的“关注参数”；而鱼类的来源/品系、饲养/繁殖条件（包括鱼的食物、水质和疾病监测）、胚胎暴露条件、测试物质的物理化学性质、测试板对照的使用以及结果和数据收集的变异性则被认为是“次要关注参数”。(1) 因此，SEAZIT项目在三个不同的实验室中进行了一项研究，测试了这些“关注参数”对基于斑马鱼胚胎的化学毒性测试结果的影响，但没有对“次要关注参数”进行标准化。正如预期的那样，研究发现，在某些情况下，39种测试物质的基准浓度（BMCs）存在显著的实验室间差异，差异幅度可达两个数量级，这取决于暴露溶液是静态的还是动态更新的，以及胚膜是完整的还是被移除的。(2) 这项研究进一步引发了关于之前认为的“次要关注参数”是否可能是导致不同实验室结果差异的原因的疑问。

尽管在过去15年中取得了关键进展，但专注于标准化检测参数的努力忽视了暴露介质的离子组成和强度作为实验变量可能对化学诱导异常的普遍性和/或严重程度产生的影响，这可能是一个需要解决的“盲点”，对于提高基于斑马鱼胚胎的检测方法的严谨性和重复性至关重要。虽然SEAZIT项目在讨论胚胎暴露条件时简要提到了“用于培养胚胎的介质不同”（例如E2培养基、E3培养基与Hanks平衡盐溶液），但研究人员认为胚胎培养基的类型不会影响测试物质的效力，因此不需要进行标准化。此外，尽管OECD测试236规定了用于饲养成年斑马鱼的维护水（pH值、硬度、温度和溶解氧）和用于暴露斑马鱼胚胎的稀释水（即暴露介质）的水质参数要求，但该测试方法并未对暴露介质中的溶质浓度提供指导，仅指出“建议稀释维护水以达到多种地表水的硬度水平”，并“可以使用其他特性明确的地表水或井水”。(3) 因此，全球的学术界、政府机构、工业界和合同研究组织的实验室在基于斑马鱼胚胎的检测中使用具有不同离子组成和强度的暴露介质，这种差异性可能导致对毒性的高估或低估。

2013年，我们首次报告称，三苯基磷酸酯（TPHP）这种广泛用于多种阻燃剂配方中的有机磷酸酯（OPE），在特定浓度下会阻碍斑马鱼胚胎的心脏发育过程。(4)

最近，我们发现暴露介质和心包水肿在TPHP暴露后胚胎发育过程中的表型结果中起着关键作用。总体而言，我们的研究表明，TPHP引起的心脏毒性（1）取决于表皮损伤、胚胎渗透调节紊乱以及心包水肿的形成；（2）并且随着暴露介质离子强度的增加而加剧，这种增加主要由高氯离子浓度引起。(5,6) 然而，在胚胎浸入暴露介质后，TPHP在胚胎表皮的吸收程度在这些不同的实验条件下并未改变，因为使用d-甘露醇（一种可以减轻TPHP引起的心包水肿的渗透性利尿剂）增加暴露介质的渗透压，或增加暴露介质的离子强度（这会加剧TPHP引起的心包水肿），都不会影响胚胎对TPHP的暴露剂量。(6) 此外，当胚胎转移到清洁水中后，TPHP引起的效应会随时间显著减轻，这与TPHP的逐渐清除有关，表明TPHP与暴露介质之间存在显著的相互作用，影响了在器官和细胞水平上观察到的表型结果。(7) 有趣的是，我们还发现，与其他结构相似的OPEs类似，其他OPEs引起的心包水肿的存在和严重程度也取决于暴露介质的离子强度和组成。(8) 这表明我们在TPHP方面的发现可能对其他能引起斑马鱼胚胎心包水肿和心脏毒性的化学物质也有普遍意义。

总体而言，我们的发现（1）引发了人们对暴露介质可能对多种化学物质（不仅仅是OPEs）在形态、生理和/或行为水平上的毒性的影响的担忧；（2）强调了在全球范围内标准化用于基于斑马鱼胚胎的化学毒性筛选和机制研究中的暴露介质的必要性。事实上，其他研究也报告称，使用d-甘露醇可以显著减轻2,3,7,8-四氯二苯并

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-二氧英（TCDD）(9)（一种典型的斑马鱼胚胎心脏毒素）和邻位及间位三苯基磷酸酯（TCP）(10)引起的心包水肿和心脏毒性。除了心包水肿和心脏发育异常作为终点外，最近的一项研究还发现，11种常用胚胎培养基（包括E2培养基、E3培养基和Hanks平衡盐溶液）中的溶质浓度变化可能会显著影响受精后5-6天的野生型和突变型斑马鱼幼体的基线感觉运动行为，(11) 这表明，除了心包水肿等形态学终点外，暴露介质的离子组成和强度以及化学诱导的损伤可能会相互作用，干扰渗透调节，从而在非致畸浓度下导致生理和/或行为反应的差异。如果这种影响适用于不同的化学物质和终点，那么暴露介质就是一个重要的“盲点”，可能会对全球基于斑马鱼胚胎的化学筛选程序产生广泛的影响，因为所使用的暴露介质类型可能会显著影响化学物质浓度-反应曲线（以及相应的BMCs），进而影响假阳性和假阴性的比率，导致错误地识别目标化学物质、优先选择化学物质，以及评估人类健康和生态风险。

总之，我们建议在学术界、政府机构、工业界和合同研究组织的实验室中统一暴露介质的离子组成和强度，以提高基于斑马鱼胚胎的化学筛选程序的严谨性和重复性。我们建议与学术界、政府和工业界的研究人员协商，像SEAZIT项目一样，开展系统的、有针对性的工作，评估暴露介质作为潜在变异来源，并为基于斑马鱼的胚胎检测方法（包括OECD测试236等测试指南）提供标准化的暴露介质建议。此外，我们建议未来的研究重点关注（1）胚胎渗透调节在调节斑马鱼生理和发育中的作用；（2）斑马鱼胚胎浸入暴露介质后，胚胎表皮作为化学物质作用的初始靶标，因为化学诱导的表皮损伤可能会扰乱斑马鱼的渗透调节，从而导致水肿形成和/或对胚胎发育过程中器官和生理的后续影响。