氧化应激通过加速重复序列不稳定性和碱基替换促进MSH2缺陷小鼠胃肠道驱动突变

《Genes and Environment》：Oxidative stress accelerates repeat sequence instability and base substitutions promoting gastrointestinal driver mutations in MSH2 deficient mice

　　本研究针对DNA错配修复（MMR）缺陷背景下氧化应激如何促进突变积累这一关键问题，通过rpsL报告基因检测、新一代测序和微卫星不稳定性分析，发现MSH2缺失使小鼠小肠突变频率增加20倍以上，氧化应激进一步加剧腺嘌呤单核苷酸重复序列的缺失突变，并鉴定出与人类MMR缺陷癌症相似的突变特征，为理解氧化应激与MMR缺陷协同驱动肿瘤发生提供了新机制见解。

　　

在我们身体的每个角落，细胞都在不断进行分裂更新，而在这个过程中，DNA复制错误和外界环境因素导致的DNA损伤如同潜伏的陷阱。特别是在胃肠道这类高增殖活性的组织中，细胞分裂频繁，使得基因组稳定性面临更大挑战。DNA错配修复（MMR）系统就像是基因组的"校对员"，能够识别并纠正复制过程中产生的错误。当这个系统失效时，就会导致突变积累加速，最终可能引发肿瘤发生。

然而，单纯MMR缺陷并不足以完全解释肿瘤的发生发展。氧化应激作为另一种重要的致癌因素，通过产生活性氧物种引起DNA损伤，与MMR缺陷可能产生协同效应。尽管已知MMR基因MSH2的缺失会导致林奇综合征（一种遗传性结直肠癌易感综合征），但氧化应激如何与MSH2缺陷相互作用，共同促进突变积累和肿瘤发生，其具体机制尚不清楚。这正是日本九州大学Mizuki Ohno教授团队在《Genes and Environment》杂志上发表的最新研究要解决的核心问题。

研究人员采用了一种巧妙的实验策略，将MSH2缺陷小鼠模型与氧化应激诱导相结合，通过多层次的突变分析手段，揭示了氧化应激如何放大MMR缺陷的遗传不稳定性效应。他们发现，即使在肿瘤形成前的正常组织中，MSH2缺失就足以使突变频率增加20倍以上，而氧化应激进一步加剧了这一效应，特别是在重复序列区域。

研究的关键技术方法包括：使用rpsL转基因小鼠进行体内体细胞突变检测，通过新一代测序技术（包括全外显子组测序和全基因组测序）分析肿瘤特异性突变谱，应用微卫星不稳定性分析评估基因组重复序列稳定性，并利用突变特征分析工具（SigProfiler）鉴定MMR缺陷和氧化应激相关的突变模式。实验样本来自MSH2基因敲除小鼠模型，包括正常小肠组织、小肠肿瘤组织以及心脏组织作为对照。

Profiling of somatic mutations in normal tissues preceding tumorigenesis using the rpsL assay

通过rpsL报告基因检测，研究人员发现MSH2^-/-小鼠小肠的背景突变频率是野生型小鼠的20倍以上。除了G>A碱基替换外，rpsL基因中腺嘌呤单核苷酸重复序列（(A)_n）频繁出现1-bp缺失。钾溴酸盐（KBrO₃）处理进一步增加了突变频率，特别是在MSH2^-/-小鼠的正常小肠上皮中插入-缺失突变（indel）显著增加。

Tumor-specific somatic mutations detected using NGS data

通过对肿瘤样本进行新一代测序分析，研究人员观察到与rpsL检测相似的突变谱，表现为高频率的indel和可比的碱基替换谱。缺失比插入更常见，C>T是碱基替换中最主要的类型。随着KBrO₃处理浓度的增加，C>A颠换比例呈剂量依赖性上升，这表明氧化剂诱导的DNA损伤在增加。

Mutational profiles in Msh2-/- tumors

突变特征分析显示，所有MSH2^-/-肿瘤中一致检测到与MMR缺陷相关的特征（SBS15、SBS44和ID2）和时钟样过程特征（SBS1和SBS5），与人类MMR缺陷癌症中观察到的特征相似。ID2特征涉及在六碱基或更长的(A/T)_n序列中发生的1-碱基缺失，支持了rpsL检测的结果。氧化应激相关特征SBS36特异性地出现在KBrO₃处理的小鼠肿瘤中。

MSI analysis

微卫星不稳定性分析显示，KBrO₃处理的MSH2^-/-小鼠肠道组织表现出最高的MSI评分，表明该器官对MSI具有高度易感性。通过香农熵分析发现，A/T、C/G和CA/TG等基序的不稳定性随重复单元数量的增加而增加，MSH2^-/-小鼠在这些基序上表现出比野生型和MMR正常小鼠更显著的长度依赖性不稳定性。

片段分析进一步证实，MSH2^-/-小鼠即使在未处理情况下也表现出基线MSI，而KBrO₃处理和年龄增长共同加剧了微卫星不稳定性。

Driver mutations in Msh2-/- tumors

研究人员在分析的六个肿瘤中鉴定出七个Apc或Ctnnb1基因的致病性驱动突变。所有五个Apc突变都是在重复序列中由1-2 bp缺失引起的移码突变，导致APC蛋白功能丧失。两个Ctnnb1突变是破坏GSK3β磷酸化位点的碱基替换。这两种基因的突变均已知会诱导Wnt信号通路的组成性激活，从而促进异常细胞增殖。

这项研究揭示了氧化应激在MMR缺陷肠道上皮中促进体细胞突变和肿瘤发生的关键作用。研究表明，MSH2缺失并不直接提供选择性生长优势，而是通过建立突变表型，促进癌症相关基因突变的积累，间接促进肿瘤发生。rpsL报告基因检测被证明是检测肿瘤发生前重复相关突变的高度敏感工具，能够揭示常规测序或片段分析方法难以捕捉的突变模式。

研究的重要意义在于阐明了环境和内源性氧化应激如何影响缺乏功能性错配修复的癌前组织中突变积累和克隆扩增。特别重要的是，该研究证明MSH2在氧化条件下对维持基因组稳定性至关重要，是氧化应激诱导肿瘤发生的关键抑制因子。这些发现为理解特定DNA修复通路在氧化应激下维持基因组完整性的协同和拮抗作用提供了新视角，也为开发针对这些网络扰动的选择性脆弱性或耐药机制的治疗策略奠定了基础。

未来研究应进一步探索氧化损伤核苷酸如何影响DNA复制稳定性，以及不同DNA修复通路之间的相互作用如何共同维护基因组完整性。这些研究将有助于更全面理解氧化应激与DNA修复缺陷协同驱动肿瘤发生的分子机制，为相关疾病的预防和治疗提供新思路。