空间转录组学揭示日本脑炎病毒神经侵袭的病理生态位：胶质细胞在早期感染中的关键作用

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Spatial gene expression analysis reveals pathological niches in Japanese encephalitis virus neuroinvasion

　　本研究通过空间转录组学技术（Xenium In Situ）首次绘制了日本脑炎病毒（JEV）感染小鼠大脑早期阶段的单细胞分辨率空间基因表达图谱。研究发现，在病毒突破血脑屏障（BBB）后，微血管周围的胶质细胞（包括少突胶质前体细胞OPCs）是JEV最早的感染靶点。研究还揭示了神经侵袭前后大脑内先天免疫反应的区域和细胞类型特异性，并发现内皮细胞紧密连接基因（如Cldn5）在感染早期即出现广泛下调。这些发现为理解JEV脑炎发病机制提供了新的视角，并提示胶质细胞在塑造大脑免疫应答景观中的早期关键作用。

　　

敏感检测皮内感染后小鼠大脑中的JEV

为了探究日本脑炎病毒（JEV）神经侵袭的早期事件，研究人员建立了三周龄C57BL/6小鼠的皮内感染模型。该模型模拟了人类感染后的致死性脑炎进程，小鼠通常在感染后7至10天死亡。通过qRT-PCR、原位杂交（ISH）和免疫组化（IHC）等技术，研究团队系统分析了感染后1至4天（dpi）病毒RNA在大脑中的水平和定位。结果显示，血清中的病毒RNA在3 dpi达到峰值，而大脑中的病毒载量则在4 dpi持续上升，表明病毒在脑组织中开始增殖。利用高灵敏度的手动ISH技术，研究人员在4 dpi的个别感染小鼠大脑中检测到了JEV RNA信号。基于此，研究采用了高度多重化的空间转录组学平台——Xenium In Situ，对1、2和4 dpi的脑切片进行分析。该平台结合了针对JEV基因组三个区域以及248个小鼠大脑基因和100个免疫相关基因的定制探针，能够在完整脑切片上以单细胞分辨率同时绘制病毒RNA和宿主基因表达图谱。分析发现，在4 dpi的两个样本（4d-1和4d-6）中检测到JEV RNA，而另一个样本（4d-3）则未检测到，这与ISH结果一致。为了准确识别感染细胞，研究人员将每个细胞中JEV RNA信号数≥3的细胞定义为感染细胞。

胶质细胞是JEV神经侵袭的初始靶点

通过Xenium分析，研究人员根据核染色和基因表达谱对细胞进行了分群和注释。在4 dpi的4d-1样本中，JEV信号仅局限于中脑微血管周围的两个病灶区域。令人惊讶的是，这些病毒信号并非位于血管内皮细胞内部，而是存在于紧邻内皮细胞的周围细胞中。通过标记基因表达谱鉴定，这些被感染的细胞包括少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。其中一个高度感染的细胞表达血小板衍生生长因子受体α（Pdgfra）、硫酸软骨素蛋白聚糖4（Cspg4）和SRY-Box转录因子10（Sox10），但不表达少突胶质细胞髓鞘相关蛋白（Opalin），其标记基因谱与少突胶质前体细胞（OPCs）的特征完全吻合。这一发现强烈提示，构成血脑屏障（BBB）周围的血管周胶质细胞是JEV神经侵袭早期阶段病毒复制的最初靶点。

在病毒载量更高的4d-6样本中，JEV信号分布更为广泛和分散，在整个大脑矢状切面上发现了约80个感染灶。研究人员将扫描区域解剖学上划分为感染已扩散的大脑皮层和大脑核团（CH区域），以及感染仍局限的丘脑和中脑（BS区域）。在BS区域，大多数细胞是少突胶质细胞和星形胶质细胞，而JEV阳性细胞也主要为少突胶质细胞。按细胞类型计算，血管柔脑膜细胞（VLMC）中的JEV阳性比例约为5%，小胶质细胞、OPCs和少突胶质细胞中的比例约为2%。相比之下，在神经元富集的CH区域，许多JEV阳性细胞是神经元和星形胶质细胞。其中，少突胶质细胞/OPCs的感染率相对较高，达到约6%。这些4 dpi的结果表明，在JEV刚刚突破血脑屏障后，胶质细胞是主要的感染靶点，而在受累更广泛的皮层区域，神经元也随后被感染。

JEV神经侵袭前大脑中的抗病毒反应

尽管在1 dpi时，通过qRT-PCR在全脑匀浆中检测到了较低水平的病毒RNA（相当于10³ PFU），但ISH和Xenium分析均未发现病毒在脑实质神经元和胶质细胞中复制的证据。然而，早在感染后第一天，许多抗病毒反应基因就已经在整个大脑中广泛表达。干扰素诱导蛋白（Ifit1, Ifit3）、干扰素调节因子（Irf9）以及信号转导和转录激活因子（Stat1, Stat2）等基因在多种细胞类型中显著上调。其他基因，如鸟苷酸结合蛋白6（Gbp6）、Irf7、ISG15（Isg15）、干扰素α诱导蛋白27 like 2A（Ifi27l2a）等，则主要在小胶质细胞/巨噬细胞、内皮细胞和VLMCs中表达升高。值得注意的是，趋化因子Ccl12（CCL2和CCL12的配体，可招募CCR2阳性单核细胞）在小胶质细胞中 robustly 诱导表达。Cxcl10的表达在整个大脑中增加，主要在内皮细胞和VLMC中，并在血管周围形成一些焦点。大多数上调的抗病毒基因在2 dpi时迅速下调。这种大脑先天免疫的快速、瞬时全局激活，与外周给予脂多糖（LPS）或Toll样受体（TLR7）激动剂后观察到的现象类似，表明即使局部的JEV皮肤感染也能触发快速的大脑先天免疫反应。

到了4 dpi，在JEV RNA阳性细胞周围区域检测到了强烈的抗病毒反应。Xenium分析显示，尽管1 dpi和4 dpi（JEV感染的4d-1样本）的脑切片中抗病毒基因（如Irf7, Ifit1, Isg15）的总转录本计数相似，但信号的分布和强度存在显著差异。在4d-1样本中，抗病毒反应不仅出现在检测到JEV信号的脑干区域，也出现在小脑和额叶大脑的部分区域，暗示在邻近的z轴切片上可能存在感染细胞。

JEV神经侵袭后星形胶质细胞中的局部I型干扰素反应

为了深入探究病毒感染微环境中的宿主基因表达，研究人员重点分析了4d-6样本BS和CH区域的单个细胞。研究发现，I型干扰素Ifna4和Ifnb1在一些围绕JEV感染细胞的旁观者细胞中高度表达。这些细胞大多是星形胶质细胞，并且它们同时共表达Il6和Ccl5（后者是招募CCR5阳性白细胞的关键趋化因子）。在BS和CH区域，单个星形胶质细胞、少突胶质细胞/OPCs、小胶质细胞或神经元中的JEV信号计数与Ifnb1表达水平之间没有检测到相关性。这表明，在单细胞水平上，Ifnb1的表达可能与细胞内JEV复制的程度无关。值得注意的是，许多Ifnb1高表达的星形胶质细胞其JEV信号低于检测限。

研究人员根据Ifna4和Ifnb1的表达水平，将JEV感染细胞周围的星形胶质细胞进一步分为Ifna/b阳性和Ifna/b阴性群体进行比较。结果显示，与Ifna/b阴性星形胶质细胞相比，Ifna/b阳性星形胶质细胞在BS和CH区域均显著高表达Ccl2、Ccl5和Il6。而其他抗病毒基因，如Cxcl10、Gbp6和Isg15，在星形胶质细胞中的表达水平则不受Ifna/b表达的影响。单个星形胶质细胞中Ifnb1的表达水平与Ccl2、Ccl5和Il6的表达水平呈正相关，但与Isg15的表达无关。有趣的是，大多数Ifna/b阳性的星形胶质细胞表现出几个星形胶质细胞标记基因（如水通道蛋白4 Aqp4、DNA结合抑制因子2 Id2、神经降压素受体2 Ntsr2）的表达水平降低。这些结果提示，具有高Ifna/b表达能力的星形胶质细胞可能是异质性星形胶质细胞中的一个特殊亚群。总之，这些发现凸显了在JEV早期神经侵袭阶段，感染灶周围特定的星形胶质细胞亚群中存在着强烈的、局域化的I型干扰素反应。

JEV感染后大脑内皮细胞紧密连接基因的广泛下调

鉴于Cxcl10和Tnf等促炎细胞因子和趋化因子基因在JEV感染早期即在大脑中表达，研究人员评估了与血脑屏障完整性相关的内皮细胞紧密连接基因的表达情况。利用Xenium数据，他们分析了单个内皮细胞中claudin-5（Cldn5）等基因的表达。与未感染样本相比，Cldn5的表达在1 dpi的JEV感染大脑中显著降低，平均log2倍变化（Log2FC）为-1.27。在2 dpi时，其表达部分恢复（Log2FC = -0.54）。到了4 dpi，基因表达水平在个体JEV感染样本间存在差异：在未检测到JEV感染细胞的4d-3样本中，Log2FC为-0.55；在感染局限的4d-1样本中，Log2FC为-0.90；而在具有多灶性JEV感染的4d-6样本中，Log2FC达到-1.35。另一个紧密连接相关基因血小板内皮细胞粘附分子1（Pecam1）的表达变化与Cldn5相似。相比之下，内皮细胞中表达的其他标记基因，如C型凝集素样跨膜蛋白（Cd93）、纤连蛋白1（Fn1）和粘附G蛋白偶联受体L4（Adgrl4），则未出现显著变化。

进一步分析显示，在JEV感染的4d-6样本的BS和CH区域，无论单个内皮细胞内是否存在JEV RNA信号，其Cldn5表达均较未感染大脑相同区域的内皮细胞显著降低。对4 dpi脑切片上Cldn5表达的空间分布分析发现，在4d-6样本中，Cldn5的下调不仅出现在感染细胞和Tnf表达细胞周围的微血管，也广泛存在于大脑的广大区域。然而，对相同脑样本中claudin-5蛋白的免疫染色却未发现微血管中claudin-5表达的显著减少。直到感染进展至7 dpi，才观察到claudin-5蛋白表达的明显下降。这些结果提示，在皮内JEV感染后，Cldn5 mRNA表达在1 dpi出现短暂降低，并在4 dpi神经侵袭期间开始再次下降，但此时claudin-5蛋白在内皮细胞中仍得以维持。随着感染的持续进展，蛋白表达的下降才可能发生，进而导致紧密连接功能受损。

这项研究通过先进的空间转录组学技术，精细地描绘了JEV神经侵袭早期阶段的细胞动力学和病理生态位，揭示了胶质细胞作为初始靶点的重要角色，以及大脑先天免疫反应和血脑屏障完整性变化的时空动态，为理解JEV脑炎的发病机制和开发早期干预策略提供了宝贵的见解。