使用恒定pH值分子动力学作为基准方法预测OmpF通道的残基电离

《PLOS Computational Biology》：Predicting residue ionization of OmpF channel using Constant pH Molecular Dynamics as benchmark

　　电静力相互作用对OmpF通道蛋白的结构和功能至关重要，尤其在膜蛋白通道中影响离子选择性。本文通过Constant pH分子动力学模拟（CpHMD）研究OmpF在pH 1-8下的电荷状态，并与PROPKA、DeepKa、基于泊松-玻恩（PB）方程的方法进行比较。发现CpHMD能更准确预测环境动态耦合的pKa值，尤其对D37、E62、E71、D126等残基的异常电荷状态（pKa<1或>8）提供合理解释，揭示邻近正电荷残基通过氢键和静电作用抑制去质子化。此外，部分残基的Henderson-Hasselbalch曲线偏离线性，可能源于构象异质性和微态平衡。研究证实CpHMD在膜蛋白系统中具有优势，需结合动态模拟和实验验证优化通道转运机制预测。

　　本研究探讨了膜蛋白通道中电荷状态变化对离子选择性和抗生素运输的重要性，特别是在大肠杆菌的外膜蛋白OmpF（孔蛋白F）中。OmpF是一种普遍的扩散孔蛋白，其功能受到环境pH值的显著影响。为了更准确地预测这类蛋白质的电荷状态，研究者采用了一种称为恒定pH分子动力学（CpHMD）的计算方法，并将其与传统的连续电荷模型（如基于泊松-玻尔兹曼方程的PB方法）以及一些经验方法（如PROPKA和DeepKa）进行了比较。通过这些方法的对比，研究揭示了不同预测方法在OmpF中的表现差异，以及某些关键残基在不同pH条件下的电荷状态变化。

在OmpF的结构中，许多酸性残基（如天冬氨酸和谷氨酸）的pH依赖性电荷状态对其功能具有决定性作用。这些残基在pH变化时，会经历显著的电离行为，而这种行为受到周围环境的强烈影响，包括与其他残基的静电相互作用、膜环境的极性差异以及水分子的动态变化。由于实验测定pKa值在膜蛋白中较为困难，因此计算方法成为研究电荷状态变化的主要工具。CpHMD作为一种基于动态模拟的方法，能够更精确地反映残基在不同pH条件下的实际电离行为，而其他方法则可能因为忽略了动态效应或对膜环境的描述不够精确，导致预测结果存在偏差。

研究中发现，某些酸性残基的pKa值表现出异常的变化，例如D37、E62、E71和D126等残基在整个pH范围（1-8）内保持电离或去电离状态，这表明它们的电荷状态受到周围环境的强烈影响。例如，D37位于三聚体蛋白的单体之间，其周围存在多个能够通过氢键或偶极相互作用稳定其电离状态的残基，如Thr39和Tyr98。此外，D126周围的正电荷残基（如R100、R132、R163、R167和R168）可能通过静电场的形成，进一步抑制了其与质子结合的可能性，从而维持其去质子化状态。这些发现表明，膜蛋白的电荷状态不仅取决于其自身的结构，还受到周围环境的动态影响。

对于某些特定残基，如D256和E296，它们的电荷状态变化与周围其他残基（如E117和D312）的电离行为密切相关。这些残基的pKa值被预测为显著低于其在溶液中的模型值，这可能是由于它们处于一个正电荷丰富的局部环境中，导致质子的结合能降低，从而更容易保持电离状态。此外，D97的电离行为也显示出非典型的趋势，其电离曲线不完全符合传统的Henderson-Hasselbalch（HH）方程，而是更接近Hill方程的拟合结果。这种现象可能源于该残基在模拟过程中经历了多种微状态的变化，其中某些微状态的电离行为与主要构象不同，从而导致整体电离曲线出现较缓的变化趋势。

研究还指出，尽管多种计算方法在预测pKa值方面表现良好，但它们在模拟膜蛋白的电荷状态时仍存在局限性。例如，基于PB的连续电荷模型通常假设蛋白质的极化环境是固定的，而未能充分考虑其动态变化。相比之下，CpHMD通过显式模拟溶剂和膜环境，能够更准确地捕捉到蛋白质结构与电离状态之间的动态耦合关系。这种动态耦合对于理解膜蛋白的功能至关重要，因为电荷状态的变化可能直接影响其离子选择性、电导率以及对特定分子（如抗生素）的通透性。

在实际应用中，OmpF的电荷状态不仅影响其离子选择性，还可能影响抗生素的运输。例如，某些研究发现，D121和E62的电离状态对抗生素（如氨苄青霉素和羧苄青霉素）的结合具有重要作用。这表明，OmpF的电荷状态不仅是结构上的特征，也是其功能调控的关键因素。此外，OmpF的电荷状态变化还可能影响其结构的动态行为，例如在pH变化时，某些残基的电离状态变化可能改变通道的构象，从而影响其通透性。

研究还分析了不同方法在预测OmpF电荷状态时的性能差异。总体来看，CpHMD在所有方法中表现最佳，其预测的pKa值与实验数据的偏差较小。而基于经验的方法（如PROPKA和DeepKa）虽然在速度和计算效率方面具有优势，但在某些情况下可能低估或高估特定残基的电离行为。这可能是由于这些方法的训练数据主要来自可溶性蛋白质，而未能充分考虑到膜蛋白的特殊环境。此外，基于PB的连续电荷模型虽然在某些情况下与CpHMD预测结果一致，但其对膜蛋白环境的建模仍存在不足。

研究结果还表明，OmpF在不同pH条件下的净电荷状态存在显著差异。例如，在中性pH条件下，CpHMD预测的净电荷为-10e，而其他方法预测的净电荷则为-12e至-13e。而在强酸性条件下（如pH 2），CpHMD预测的净电荷为+21e，而其他方法的预测结果则更高，达到+26e或+28e。这些差异可能源于不同方法对膜环境和极化效应的处理方式不同，也表明净电荷不能完全代表膜蛋白的电荷状态变化。

为了更全面地理解OmpF的电荷行为，研究还探讨了其在不同pH条件下的电导率和反转电位（RP）变化。RP是衡量膜蛋白离子选择性的关键指标，它反映了在不同pH条件下，通道对阳离子和阴离子的选择性差异。研究发现，不同方法预测的RP曲线与CpHMD结果存在一定的偏差，这可能是因为这些方法未能充分考虑电荷分布的空间差异，或者对膜电荷环境的建模不够精确。

综上所述，本研究通过CpHMD方法对OmpF的电荷状态进行了系统分析，揭示了其在不同pH条件下的电离行为及其对功能的影响。研究还指出，基于经验的方法和PB模型在预测膜蛋白的电荷状态时存在局限性，而CpHMD能够更准确地模拟这些动态变化。这些发现不仅有助于理解OmpF的结构与功能之间的关系，也为未来研究膜蛋白的离子选择性和抗生素运输提供了重要的参考数据。此外，研究还强调了电荷状态变化与蛋白质构象动态之间的复杂相互作用，这对于进一步研究膜蛋白的运输机制和结构功能关系具有重要意义。