健康人肠道细菌发酵产氢的关键酶：广泛存在的B群[FeFe]-氢化酶

《Nature Microbiology》：A widespread hydrogenase supports fermentative growth of gut bacteria in healthy people

　　本研究针对肠道氢循环失调与胃肠疾病关联的机制难题，通过宏基因组、转录组与生化分析，揭示B群[FeFe]-氢化酶是健康人肠道细菌发酵产氢的主导酶，并发现拟杆菌属为重要产氢菌；该酶基因在克罗恩病患者中显著减少，为肠道微生物能量代谢与疾病治疗提供了新靶点。

　　

在人体肠道这个复杂的微生物生态系统中，氢气(H₂)扮演着核心角色。它由发酵细菌在分解碳水化合物时产生，又被氢营养微生物消耗，用于能量守恒和碳固定。这种氢循环的平衡对维持肠道健康至关重要，一旦失调就与肠易激综合征、胃肠道感染甚至癌症等多种疾病密切相关。然而，尽管氢代谢如此重要，科学界对肠道中具体是哪些微生物、通过哪些酶来主导氢循环过程，长期以来却知之甚少。传统观点认为，产氢主要由梭菌纲(Clostridia)细菌利用典型的A1群[FeFe]-氢化酶([FeFe]-hydrogenase)完成，而耗氢则主要由产甲烷古菌、产乙酸菌和硫酸盐还原菌这三类经典氢营养微生物负责。但近年来的基因组调查发现，一种被称为B群[FeFe]-氢化酶的基因在肠道微生物中广泛存在，其功能却一直是个谜。这提示我们，对肠道氢循环的认知可能还存在巨大的空白。

为了揭开肠道氢循环的完整面貌，由Caitlin Welsh、Samuel C. Forster和Chris Greening领导的研究团队开展了一项多层次的研究。他们综合利用了宏基因组学、宏转录组学、微生物培养、转录组测序、生物化学分析和光谱学技术，对健康人群和患者的粪便及肠道黏膜活检样本进行了深入分析。研究的关键技术方法包括：对300份粪便宏基因组、78份配对宏转录组以及102份来自42名儿童的肠道黏膜活检样本进行氢化酶基因同源性搜索和定量；培养19株系统发育多样的肠道细菌分离株，通过气相色谱检测其产氢能力；对7株拟杆菌进行转录组测序以分析代谢通路；利用AlphaFold2进行蛋白质结构预测；异源表达并半合成成熟氢化酶以检测酶活；通过全细胞电子顺磁共振(EPR)光谱验证活性中心；以及基于大规模病例对照研究（871名健康人与790名患者）比较不同健康状态下氢化酶基因的丰度差异。

Group B [FeFe]-氢化酶基因在人类肠道中广泛存在且活跃转录

研究人员首先通过分析300份人类粪便宏基因组发现，氢化酶基因在肠道中极为丰富，平均每个生物体有1.44±0.58个拷贝。其中，功能未知的B群[FeFe]-氢化酶基因最为丰富（0.75±0.25 拷贝/基因组），其丰度远高于此前被认为是主要产氢酶的A1群[FeFe]-氢化酶（0.10±0.09 拷贝/基因组）以及在反刍动物中主导产氢的A3群[FeFe]-氢化酶（0.19±0.11 拷贝/基因组）。对78份宏转录组的分析进一步证实，B群[FeFe]-氢化酶基因的转录本数量最多，其表达水平（95±86 RPKM）是A3群、A1群和4a群[NiFe]-氢化酶的3.3倍、4.7倍和26倍，表明其具有很高的转录活性。基因分布分析显示，B群[FeFe]-氢化酶基因广泛存在于62%的肠道细菌分离株中，覆盖厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)等主要门类。特别是在高丰度的拟杆菌属(Bacteroides)中，该基因的宏基因组和宏转录组读数最多。对102份肠道黏膜活检样本宏基因组的分析得到了高度一致的结果，B群[FeFe]-氢化酶基因同样是其中最丰富的氢化酶基因，主要编码者也是拟杆菌属，这表明该酶在整个肠道中都可能对发酵产氢有重要贡献。

Group B [FeFe]-氢化酶在多种肠道分离株中表达且具有活性

为了验证B群[FeFe]-氢化酶是否确实具有产氢活性，研究人员检测了19株具有系统发育和生理多样性的肠道细菌分离株在发酵条件下的产氢情况。在13株编码B群[FeFe]-氢化酶基因的分离株中，除1株外，其余均产生了高水平的H₂。这包括7株拟杆菌，它们在发酵生长期间能快速产生H₂，使顶空H₂平均最高水平达到3.0±0.6%，以及4个来自梭菌纲的属。转录组测序结果显示，在发酵生长6小时后，这7株拟杆菌的B群[FeFe]-氢化酶基因均高水平表达（平均180 TPM），而其中三株同时编码的A3群[FeFe]-氢化酶复合物基因在此生长条件下转录水平极低（平均3.5 TPM）。不编码任何氢化酶基因的Bacteroides stercoris则未检测到产氢。这些结果强有力地证明，B群[FeFe]-氢化酶是拟杆菌在发酵生长过程中产氢的主要原因。

B群[FeFe]-氢化酶的结构、生化特性及其在拟杆菌发酵中的作用机制

通过AlphaFold2结构建模发现，B群[FeFe]-氢化酶与典型的A1群[FeFe]-氢化酶结构不同，它包含两个独特的球状结构域：一个H簇结构域（含有典型的催化H₂结合的H簇和两个[4Fe-4S]簇）和一个不寻常的较小的铁氧还蛋白样结构域（含有两个非路径[4Fe-4S]簇），两者通过一个短的柔性连接子连接。研究人员成功异源表达并半合成了三种不同拟杆菌来源的B群[FeFe]-氢化酶，均检测到H₂产生，而B. thetaiotaomicron的A3群酶在相同条件下活性很低。全细胞EPR光谱证实B. fragilis的B群[FeFe]-氢化酶产生了与典型H簇一致的光谱特征。对拟杆菌转录组的分析表明，它们都是混合酸发酵菌，能够通过糖酵解途径将糖分解为丙酮酸，并通过丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，进而产生乙酸。生化实验显示，在B. fragilis细胞提取物中加入PFOR的底物辅酶A(CoA)和丙酮酸，可使H₂产量增加14倍，而PFOR抑制剂硝唑尼特(NTZ)则能终止H₂的产生，证明PFOR活性为氢化酶提供了还原力，B群[FeFe]-氢化酶在发酵过程中负责重新氧化被PFOR还原的铁氧还蛋白，并将多余的电子以H₂的形式排出。

Group B [FeFe]-氢化酶在胃肠道疾病及其他疾病中减少

最后，研究人员比较了健康个体与慢性疾病患者（特别是克罗恩病）粪便宏基因组中氢化酶相关基因的水平。结果显示，B群[FeFe]-氢化酶基因的平均水平在健康个体（0.72±0.17 拷贝/基因组）中显著高于克罗恩病患者（0.56±0.24 拷贝/基因组）。与之相反，典型的发酵产氢酶A1群[FeFe]-氢化酶基因、甲酸氢裂解酶（4a群[NiFe]-氢化酶）基因以及A3群[FeFe]-氢化酶基因在克罗恩病患者中的平均水平分别增加了2.8倍、5.2倍和1.4倍。最显著的变化是，B群与A1群[FeFe]-氢化酶基因的比率在两个队列之间发生了2.3倍的偏移。此外，用于H₂氧化的呼吸性1d群[NiFe]-氢化酶基因在克罗恩病患者中也增加了2.6倍。在动脉粥样硬化、肝硬化、结直肠癌和2型糖尿病等其他慢性疾病状态中也观察到了A1群基因相对于B群[FeFe]-氢化酶基因的显著富集。

这项研究通过整合酶学、细胞和肠道生态系统水平的分析，提供了多方面的证据，表明B群[FeFe]-氢化酶在多种细菌中介导H₂生产，并驱动健康人类肠道中的发酵过程。它颠覆了传统认知，揭示拟杆菌属作为此前未被认识的主要产氢菌，在肠道氢循环中扮演着比最初理解更为核心的角色，并使用了一种功能先前未知的氢化酶。研究还提出了对肠道氢消耗范式的新见解，指出使用延胡索酸、硝酸盐和亚砜等电子受体的呼吸性细菌，而非经典的产甲烷菌、产乙酸菌和硫酸盐还原菌，可能是肠道中主要的氢营养微生物，尤其是在疾病状态下富集的肠杆菌科。该研究发现的B群[FeFe]-氢化酶基因在健康人中尤为丰富，可能成为氢稳态的指标，而在克罗恩病等疾病状态下则向A1群[FeFe]-氢化酶基因倾斜，这为理解肠道微生物能量代谢与疾病关系开辟了新途径，对未来开发基于微生物组的诊断和治疗方法具有重要意义。