定量暴露组学：在皮摩尔水平上针对200多种有毒物质和关键生物标志物

《Environmental Science & Technology》：Quantitative Exposomics Targeting over 200 Toxicants and Key Biomarkers at the Picomolar Level

　　多类化学物质痕量检测LC-MS/MS工作流程开发及在孕妇队列中的应用，结合96孔板固相萃取和质谱分析，实现230+种生物标志物的灵敏检测（LOD<0.1 ng/mL），验证方法稳定性（回收率60-130%，RSD<30%），提出ExWAS定制化验证标准（RE 42-134%，RSD<37%），在50名孕妇四阶段采样中检测到PFAS、药物、农药等109种化合物，发现新型毒素如大黄酸酯。

　　本文介绍了一种新型的、可扩展的人类生物监测（HBM）工作流程，旨在对尿液、血浆和血清中超过230种暴露生物标志物进行分析。该方法结合了固相萃取（SPE）与液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）技术，适用于大规模暴露组学关联研究（ExWAS）。文章还提出了一种补充性的概念框架，用于评估分析方法的验证标准，以适应大规模、高度多样化的化合物检测需求。通过在50名孕妇的尿液样本中进行应用验证，该方法不仅展现了其高灵敏度和稳健性，还首次检测到多种新型化学物质，为环境健康研究提供了重要的数据支持。

### 研究背景与意义

暴露组学（exposomics）是一门研究个体在整个生命周期中所接触的环境化学物质及其对健康和疾病影响的科学。与传统的毒理学研究不同，暴露组学强调对环境中多种化学物质的全面评估，包括空气污染物、药物、食品加工污染物、塑料相关化学物质、真菌毒素、工业产品、内分泌干扰物等。这些化学物质在人体中的浓度通常非常低，常处于皮摩尔（pM）或纳摩尔（nM）水平，因此对检测方法提出了极高的灵敏度和特异性要求。

在目前的暴露组学研究中，常用的检测方法包括靶向分析（targeted analysis）和非靶向分析（non-targeted analysis, NTA）。靶向分析适用于已知化合物的精确定量，具有高灵敏度和选择性；而非靶向分析则用于发现未知化学物质，拓展对暴露组的了解。然而，现有的方法往往局限于特定类型的化合物，或者在大规模样本分析中表现不足。因此，开发一种既具有广泛覆盖能力，又具备高灵敏度和可扩展性的分析方法，对于推动暴露组学研究至关重要。

本文提出的HBM工作流程，旨在克服这些限制。通过使用96孔板固相萃取技术，结合高灵敏度的LC–MS/MS分析，该方法能够同时检测多种化学物质，涵盖广泛的理化性质范围。此外，文章还提出了一种新的验证框架，用于评估大规模暴露分析中方法的性能，从而提高研究结果的可靠性和可比性。

### 方法概述

该研究采用了一种可扩展的LC–MS/MS分析流程，以分析尿液、血浆和血清中的多种暴露生物标志物。首先，研究人员使用固相萃取技术对样本进行预处理，以去除干扰物质并提高检测灵敏度。随后，利用液相色谱-串联质谱技术对目标化合物进行检测。整个流程经过严格的方法验证，包括线性范围、灵敏度、精密度、回收率以及矩阵效应的评估。

研究团队开发了一个包含234种化合物的分析面板，涵盖了多种化学类别，包括全氟烷基化合物（PFAS）、药物、个人护理产品、空气污染物、农药、阻燃剂、真菌毒素、工业化学品、食品加工副产物、塑料相关化学物质、消毒剂及其副产物、植物毒素和植物雌激素，以及内源性雌激素。为了确保检测的准确性，研究人员使用了多种同位素标记的内标物，并在不同阶段加入以跟踪仪器性能和样本基质的影响。

在方法优化过程中，研究团队对保留时间（RT）窗口和停留时间（dwell time）进行了调整，以确保在复杂样本基质中能够获得高质量的分析结果。同时，通过优化多反应监测（MRM）参数，提高了方法的灵敏度和特异性。实验结果显示，该方法在尿液和血浆中具有较高的回收率（60–130%）和较低的基质效应（SSE，60–130%），并且在日内和日间重复性方面表现出良好的稳定性（RSD < 30%）。此外，该方法的检测限（LOD）低于0.1 ng/mL，适用于低浓度暴露物的检测。

### 验证标准的提出

为了确保该方法适用于大规模暴露组学研究，研究团队还提出了一个补充性的验证框架。该框架基于对现有文献中大规模暴露分析方法的系统评估，并结合本研究中的实验数据，以适应暴露组学的特殊需求。传统的欧洲委员会（EC）验证标准适用于较高浓度的化合物，但对于暴露组学中常见的低浓度化合物，这些标准可能不够适用。因此，研究团队提出了一种新的、基于实证数据的验证标准，以更准确地评估方法在低浓度条件下的性能。

新的验证标准将分析物的回收率（RE）和重复性（RSD）设为关键参数，并根据浓度范围设定了不同的接受标准。例如，对于浓度低于1 ng/mL的化合物，RE在42%至134%之间被认为是可接受的；而对于浓度在1–10 ng/mL之间的化合物，RE在70%至120%之间。此外，RSD值也根据浓度范围进行了调整，以确保方法的稳定性和可重复性。这些标准为暴露组学研究提供了一个更合适的验证方案，有助于提高不同研究之间的可比性。

### 方法性能评估

在对方法性能进行评估时，研究团队使用了多种质量控制（QC）样本，包括未加标样本（nonspiked QC）、加标后样本（postspiked QC）和加标前样本（prespiked QC）。通过对这些样本的分析，研究人员能够全面评估方法的线性范围、灵敏度、精密度和回收率。实验结果显示，88%的化合物在纯溶剂中表现出良好的线性关系（R2 > 0.99），并且大多数化合物的检测限（LOD）低于0.1 ng/mL。

在尿液和血浆样本中，研究团队分别检测了200个样本，并对其中的109种目标化合物进行了定量分析。其中，25种化合物的检测频率超过70%，表明该方法在实际研究中的适用性。此外，该方法还能够检测到多种新型化学物质，如某些植物毒素和真菌毒素，这些物质在以往的美国尿液生物监测研究中未曾被检测到。这一结果不仅扩展了暴露组学研究的化学覆盖范围，还为环境健康研究提供了新的视角。

### 实际应用与结果分析

为了验证该方法在实际研究中的适用性，研究团队将其应用于美国一项长期妊娠队列研究（YPOPS）的200个尿液样本。这些样本来自50名孕妇，在妊娠第12、20、28和36周分别采集。通过分析这些样本，研究人员能够观察到多种化学物质在不同妊娠阶段的浓度变化趋势。

研究结果显示，一些化合物在妊娠期间表现出显著的浓度变化。例如，九种内源性激素、一种杀虫剂（乙酰氨基吡啶）和一种植物雌激素（大豆异黄酮）的浓度在不同妊娠阶段呈现上升趋势（p < 0.05）。而乙基对羟基苯甲酸酯（ethylparaben）以及四种塑料增塑剂（如单丁基邻苯二甲酸酯、单苯基邻苯二甲酸酯、双酚F和双酚S）的浓度则在妊娠期间显著下降（p < 0.05）。这些结果表明，该方法能够有效捕捉到不同化学物质在妊娠过程中的动态变化。

此外，研究团队还检测到了多种真菌毒素和农药代谢物。例如，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是尿液中最常见的真菌毒素之一，其浓度在样本中被检测到，且在部分样本中达到较高水平。对于一些极低浓度的化合物，如某些真菌毒素和植物毒素，该方法的灵敏度得到了显著提升，使得这些物质能够在尿液中被准确检测。例如，一种名为贝亚弗菌素（beauvericin）的真菌毒素，此前在尿液生物监测研究中未被检测到，但本研究中首次发现其存在。

### 方法的局限性与改进方向

尽管该方法在灵敏度、回收率和重复性方面表现出色，但仍存在一些局限性。首先，该方法仅覆盖了暴露组中的一部分化学物质，无法全面反映所有可能的环境暴露。因此，未来的研究可能需要结合多种分析技术，以实现更广泛的化学覆盖。其次，某些极性化合物在固相萃取过程中可能被损失，导致回收率较低。此外，部分化合物在样本基质中表现出较强的基质效应，可能影响检测结果的准确性。

为了解决这些问题，研究团队建议采用多种互补的方法，例如结合固相萃取与液液萃取（LLE）或不同的色谱分离技术。然而，这些方法可能会增加实验的时间和成本。因此，在大规模暴露组学研究中，需要在化学覆盖范围、样本清洁度、方法灵敏度和分析效率之间找到一个平衡点。

### 方法的创新与应用前景

本文提出的方法不仅在技术上具有创新性，还具有重要的应用价值。首先，该方法通过使用96孔板固相萃取技术，显著提高了样本处理的效率。相比于传统的离心管处理方法，这种方法减少了约10倍的实验室工作量，使得大规模样本分析成为可能。其次，该方法在灵敏度方面表现出色，能够检测到低浓度的暴露物，这对于研究低剂量暴露与健康效应之间的关系至关重要。

此外，该方法还能够同时检测多种类型的化学物质，包括药物、农药、食品加工副产物、塑料相关化学物质、真菌毒素等，为暴露组学研究提供了更全面的视角。在实际应用中，该方法已被成功用于美国妊娠队列研究，显示出其在环境健康研究中的潜力。

### 未来展望

随着暴露组学研究的不断发展，对高灵敏度、高通量和广泛覆盖的分析方法的需求日益增加。本文提出的方法为这一领域提供了一个可行的解决方案，其性能指标符合大规模暴露组学研究的要求。未来，该方法可以进一步优化，以提高对更多类型化合物的检测能力，并应用于其他人群和环境背景下的研究。

此外，研究团队提出的新的验证框架为暴露组学研究提供了一个参考标准，有助于提高不同研究之间的可比性和数据质量。这一框架的建立不仅推动了暴露组学方法的标准化，还为未来的研究提供了理论支持和实践指导。

总之，本文提出的方法在暴露组学研究中具有重要的应用价值，能够有效检测多种化学物质，并适用于大规模样本分析。通过结合固相萃取与液相色谱-串联质谱技术，该方法在灵敏度、回收率和重复性方面表现出色，为环境健康研究提供了强有力的技术支持。