细菌单细胞基因组学的湿实验室准备及自动化数据集去污染流程

《Methods in Ecology and Evolution》：Wet-lab preparation and automated dataset decontamination procedure for bacterial single-cell genomics

　　单细胞基因组测序中提出通用制备流程及自动化去污染工具SINCERE-DATA，通过小体积样本制备和多标签扩增提升通量，利用覆盖率异常及分类学分析检测并去除环境DNA和试剂污染，显著提高数据质量。

　　在微生物学领域，单细胞基因组学（Single-Cell Genomics, SCG）已经成为研究微生物基因组结构、多样性及进化过程的重要工具。这项技术的核心在于从单个细胞中提取基因组信息，从而避免传统宏基因组学中可能出现的基因片段拼接错误和污染问题。然而，由于单细胞基因组的构建过程中存在多种污染来源，包括实验操作中的生物污染和试剂污染，以及扩增过程中产生的非目标DNA序列，这些污染严重影响了单细胞基因组数据的质量。因此，开发一种高效的、可重复的单细胞基因组数据去污染方法显得尤为重要。

本研究提出了一种适应性强且通用的单细胞基因组数据去污染流程，名为SINgle-CEll REads Decontamination through Automatic Taxonomic Assignation（SINCERE-DATA）。该流程通过结合基因组组装的覆盖度差异和读取序列的分类信息，系统地识别并去除污染序列。与现有方法相比，SINCERE-DATA能够在保持目标DNA完整性的同时，更有效地检测和清除污染。这种自动化方法不仅提高了处理效率，还减少了人为操作带来的不一致性，从而提升了单细胞基因组数据的可靠性。

为了验证这一流程的有效性，研究人员将SINCERE-DATA应用于来自不同环境的已发表单细胞基因组数据集，包括海洋微生物、水稻根际微生物和人体口腔及粪便微生物。结果显示，SINCERE-DATA在去除污染序列方面表现优异，特别是在处理含有大量污染的样本时，其效果优于其他常用工具，如MDMcleaner和MAGpurify。这些工具虽然在一定程度上能够识别污染，但往往无法准确区分污染序列与目标基因组中的真实变异，从而导致数据质量下降。而SINCERE-DATA则通过读取序列的分类信息和覆盖度分析，能够更精确地识别出污染区域，并将其从数据集中移除。

此外，本研究还优化了单细胞基因组的制备流程，采用更小的反应体积和定制的条形码引物，以提高样本处理的效率和多样性。这种优化不仅降低了实验成本，还提升了单细胞基因组的回收率和准确性。实验结果显示，使用SINCERE-DATA进行去污染后，基因组组装的长度和完整性均有所提高，尤其是在海洋和水稻根际数据集中。同时，这种方法在保持非污染短序列的同时，能够有效去除可能影响基因组质量的污染序列，从而提升了单细胞基因组的纯度和代表性。

在讨论部分，研究指出，尽管SINCERE-DATA在去除污染方面表现出色，但它仍然受到现有基因组数据库的限制。某些环境样本中的基因组信息可能未被充分收录，导致去污染过程中遗漏部分潜在污染。因此，未来的研究可以探索使用更先进的基因组分析技术，如k-mer多样性统计，以提高对未识别污染的检测能力。此外，由于环境样本中微生物的多样性较高，SINCERE-DATA在分类精度上可能受到一定限制，主要停留在属水平的识别上。不过，该流程仍然能够有效地排除大部分污染，并为后续的基因组分析提供更清晰的数据基础。

本研究的结论表明，通过结合实验方法和生物信息学处理流程，单细胞基因组学能够在减少污染和提高数据质量方面取得显著进展。未来，随着技术的进一步发展，单细胞基因组学有望成为研究微生物群落结构和功能的新工具，甚至可能替代传统宏基因组学方法。同时，该方法还可以用于提升环境样本中宏基因组的纯度和代表性，从而更准确地反映微生物群落的真实状态。研究团队还强调，SINCERE-DATA作为一种可定制的自动化工具，能够根据不同的数据集调整参数，以更好地适应不同研究需求。

在方法部分，研究人员详细描述了单细胞基因组的制备过程，包括细胞分离、基因组扩增、片段化、连接适配器以及最终的测序和数据分析步骤。这些步骤的优化使得整个流程更加高效和标准化，为后续的去污染工作奠定了基础。在实验中，研究人员使用了两种不同的基因组扩增试剂，分别来自QIAGEN和NEB，并对它们进行了比较分析。结果显示，无论是哪种试剂，SINCERE-DATA都能有效去除污染，且对目标基因组的完整性影响较小。

通过使用SINCERE-DATA，研究人员不仅提高了单细胞基因组数据的准确性，还增强了不同数据集之间的可比性。这对于研究微生物群落的结构和功能具有重要意义，因为不同研究之间的数据对比往往受到污染程度和处理方法的影响。此外，SINCERE-DATA的使用还能够帮助研究人员更好地理解基因组污染的来源和机制，从而为未来实验设计提供参考。

总的来说，SINCERE-DATA的提出为单细胞基因组学提供了一种新的解决方案，能够在保证数据质量的前提下，提高实验效率和数据处理的自动化水平。这一流程的广泛应用有望推动微生物学研究的深入发展，并为理解微生物多样性提供更加可靠的数据支持。