靶向抑制MLKL介导的程序性坏死可减轻亚砷酸盐慢性暴露诱导的肺损伤

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Targeted inhibition of MLKL-mediated necroptosis attenuates chronic arsenite exposure-induced lung injury

　　本研究针对慢性砷暴露所致肺损伤的分子机制尚不明确的问题，聚焦于程序性坏死（necroptosis）这一新型细胞死亡方式。研究人员通过体内外实验证实，亚砷酸钠（NaAsO2）可激活RIPK1-RIPK3-MLKL信号轴，诱导肺上皮细胞发生MLKL介导的程序性坏死，进而驱动肺部炎症和纤维化。关键发现是，MLKL基因敲除或使用特异性抑制剂（Nec-1、GSK872、NSA）能显著减轻砷诱导的肺损伤。该研究揭示了程序性坏死在砷毒性中的核心作用，为砷相关呼吸系统疾病的精准防治提供了新靶点。

　　

砷，这种广泛存在于环境中的有毒类金属，通过饮用水污染等途径对全球公共卫生构成严重威胁。尽管流行病学研究早已将慢性砷暴露与多种呼吸系统疾病联系起来，但其导致肺损伤的具体分子机制却如同笼罩在迷雾中，亟待揭示。这不仅阻碍了我们对砷毒性本质的理解，也限制了有效防治策略的开发。近年来，一种名为“程序性坏死”（necroptosis）的细胞死亡方式引起了科学家的广泛关注。它不同于安静的程序性死亡“凋亡”（apoptosis），而是一种具有“促炎”特性的细胞死亡形式，由RIPK1、RIPK3和MLKL等分子组成的信号通路精密调控。当这条通路被异常激活时，会像在细胞膜上“凿洞”，导致细胞内容物泄漏，进而引发强烈的炎症反应。那么，这种“轰轰烈烈”的细胞死亡方式，是否在砷悄无声息地损害我们肺部健康的过程中扮演了关键角色呢？

为了回答这个关键问题，来自西安交通大学第二附属医院的研究团队在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了一项重要研究。他们大胆假设，慢性砷暴露会“劫持”肺上皮细胞中的RIPK1–RIPK3–MLKL通路，启动程序性坏死，从而在肺部引发一场“坏死-炎症”的恶性循环，最终导致肺组织结构和功能的破坏。

为了验证这一假说，研究人员精心设计并开展了一系列体内和体外实验。在细胞层面，他们使用人肺上皮细胞系BEAS-2B，用不同浓度的亚砷酸钠（NaAsO₂）进行处理，并联合应用了多种程序性坏死特异性抑制剂（如靶向RIPK1的Nec-1、靶向RIPK3的GSK872以及靶向MLKL的NSA）。他们通过CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术分析细胞凋亡和坏死情况，并通过蛋白质印迹法（Western blot）检测程序性坏死关键蛋白（如p-RIPK3和p-MLKL）的磷酸化水平。在动物层面，他们构建了慢性砷暴露的小鼠模型，通过饮用水让小鼠长期接触不同剂量的NaAsO₂。更关键的是，他们还利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了MLKL基因敲除（Mlkl^-/-）小鼠，用以直接评估MLKL在砷致肺损伤中的必要性。通过对小鼠肺组织进行苏木精-伊红（H&E）染色、Masson染色（评估胶原沉积和纤维化）、免疫组织化学染色以及酶联免疫吸附测定（ELISA）等分析，全面评估了肺部病理损伤、炎症水平和纤维化程度。

研究结果层层递进，有力地证实了他们的科学假设。

3.1. 亚砷酸盐诱导肺上皮细胞产生剂量和时间依赖性细胞毒性

研究人员发现，NaAsO₂能以剂量依赖的方式显著降低BEAS-2B细胞的活力，并诱导细胞出现凋亡和坏死。随着暴露时间的延长，细胞毒性也愈发明显。这首先确认了砷对肺上皮细胞的直接损伤作用。

3.2. 慢性亚砷酸盐暴露诱导小鼠肺损伤

在动物实验中，随着饮水中砷浓度的增加，小鼠肺组织出现了进行性加重的病理改变：肺泡结构破坏、间质增厚、炎症细胞浸润、胶原纤维异常沉积（即纤维化）。同时，血清和肺组织中的促炎细胞因子IL-6和TNF-α水平升高，而肺上皮屏障功能的重要标志物CC16水平下降。这些结果完美模拟了人类慢性砷暴露可能导致的肺部病变。

3.3. 亚砷酸盐暴露在BEAS-2B细胞和小鼠肺组织中诱导程序性坏死

这是本研究的核心发现之一。蛋白质印迹和免疫组化结果清晰地显示，无论是在体外培养的细胞还是体内小鼠的肺组织中，砷暴露都导致了程序性坏死通路关键蛋白RIPK3和MLKL的磷酸化水平显著上调，且这种上调是剂量依赖性的。值得注意的是，在肺组织中，这些被激活的蛋白主要分布在支气管周围和血管周围区域，提示这些区域的细胞是砷攻击的主要靶点。

3.4. Mlkl基因敲除减轻亚砷酸盐诱导的小鼠肺部炎症和纤维化

为了确证MLML介导的程序性坏死是砷致肺损伤的关键环节，研究人员使用了Mlkl^-/-小鼠。结果非常令人振奋：与野生型小鼠相比，在遭受相同剂量砷暴露后，Mlkl^-/-小鼠的肺组织损伤、炎症反应和纤维化程度都得到了显著减轻。这一遗传学证据强有力地表明，敲除MLKL基因，阻断了程序性坏死的最终执行步骤，从而保护了肺部免受砷的严重损害。

3.5. 程序性坏死抑制剂减轻亚砷酸盐诱导的肺上皮细胞毒性

在细胞水平上，研究人员使用了药理学方法进行干预。他们发现，提前用Nec-1、GSK872或NSA处理细胞，都能有效逆转NaAsO₂引起的细胞活力下降和死亡增加。这表明，通过药物抑制程序性坏死通路上的不同节点，都能实现对细胞的保护。

3.6. 药理学抑制RIPK1-RIPK3-MLKL轴减轻NaAsO₂诱导的肺上皮细胞程序性坏死

进一步的机制探索表明，Nec-1和GSK872的保护作用，正是通过抑制其下游蛋白RIPK3和MLKL的磷酸化来实现的。这从药理学角度印证了程序性坏死通路在砷毒性中的核心地位。

综上所述，本研究通过严谨的体内外实验，首次系统地阐明了MLKL介导的程序性坏死是慢性砷暴露导致肺损伤的一个核心机制。砷通过激活RIPK1-RIPK3-MLKL信号轴，引发肺上皮细胞的炎症性死亡，进而破坏肺屏障，促进炎症和纤维化进程。而无论是基因敲除MLKL还是使用特异性抑制剂阻断该通路，都能有效减轻肺损伤。

这项研究的结论具有重要的科学意义和潜在的转化价值。它不仅为理解环境毒物砷的致病机制提供了全新的视角，将程序性坏死这一前沿概念与经典的砷毒性研究联系起来，而且明确指出了MLKL是一个极具潜力的治疗靶点。这意味着，未来有可能通过开发靶向MLKL的药物，来预防或治疗由砷暴露引起的呼吸系统疾病，为生活在高砷地区的人们带来新的希望。当然，正如作者在讨论中所言，未来的研究还需要进一步阐明程序性坏死与其他细胞死亡方式（如凋亡、焦亡）的交互作用，并评估长期抑制MLKL的安全性。但毫无疑问，这项研究为我们对抗砷这一古老毒物的健康危害，点亮了一盏新的指路明灯。