剂量依赖性蛋白质组学揭示城市污水处理中芬顿氧化诱导的纳米塑料毒性转化

　　本研究针对污水处理过程中纳米塑料经芬顿氧化转化后的毒性变化机制尚不明确的问题，通过模拟城市污水处理中的芬顿氧化过程，系统比较了原始与芬顿处理后的聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）的理化性质及毒理学效应。研究发现，芬顿处理显著改变了PS-NPs的表面特性（如粗糙度增加、粒径减小、Zeta电位更负），并在体外细胞模型（MN9D多巴胺能神经元）和体内模式生物（秀丽隐杆线虫，Caenorhabditis elegans）中诱导了不同的毒性反应：原始PS-NPs更强地抑制神经元活力，而芬顿处理后的PS-NPs则诱导更高的活性氧（ROS）水平，并显著损害线虫的运动、发育和衰老相关表型。蛋白质组学分析进一步揭示了其对核糖体功能、碳代谢及生殖通路等关键生物学过程的干扰。该研究为深入理解污水处理过程中微塑料的生态风险转化机制提供了重要见解，发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》。

　　

随着全球塑料制品的大规模生产与消费，塑料废弃物在自然环境中的持续累积问题日益严峻。尤其在城市化加速和居民生活水平提高的背景下，各种塑料包装、日用品和纺织纤维不断进入城市污水系统，并在物理、化学及生物过程的共同作用下逐渐分解为微塑料（MPs）。这些尺寸小于5毫米的固体颗粒，因其重量轻、体积小、移动性强及环境稳定性高等特点，广泛分布于地表水、沉积物、土壤、大气和污水中，已被视为一种新型环境污染物并引发全球关注。在城市污水处理系统中，微塑料作为持久性污染物之一，其去除效率受多种因素影响。传统污水处理工艺（如初级沉淀、活性污泥法、生物膜法等）可部分去除较大的微塑料颗粒，但对较小粒径，尤其是纳米级的微塑料几乎无效。现有研究表明，污水处理厂在初级处理过程中对微塑料的去除率可达60%–80%，而对纳米级微塑料的去除率往往较低，甚至可能全部随出水进入受纳水体，对水生生态系统及饮用水安全构成严重威胁。纳米级微塑料不仅具有更强的环境迁移性和生物渗透性，还能通过食物链在生物体内累积，诱发多种毒理学反应，严重威胁水生生物和人类健康。

近年来，为应对传统处理工艺难以有效去除新兴污染物的问题，城市污水处理厂逐步引入各种高级氧化工艺（AOPs），如臭氧氧化、光催化、过硫酸盐氧化及芬顿（Fenton）氧化等。其中，芬顿氧化因其反应条件温和、处理成本低、氧化能力强等优点，被广泛应用于高级废水处理，可高效降解多种难降解有机污染物。芬顿反应以Fe²⁺为催化剂，在酸性条件下与H₂O₂反应生成高反应活性的羟基自由基（•OH）。该自由基具有极高的氧化还原电位，可非选择性地攻击有机分子的碳链结构，从而引发断链、羟基化、羧基化等一系列化学反应，显著改变污染物的结构和理化性质。当芬顿氧化应用于微塑料处理时，研究表明其可能不会直接完全矿化塑料颗粒，但能在颗粒表面引入大量含氧官能团（如羧基、羟基、酮基等），显著改变其表面粗糙度、亲水性、电荷状态及胶体稳定性。这些变化一方面有利于其在水处理过程中的絮凝、吸附或分离；另一方面也可能赋予其更高的活性和反应性，从而增强其与生物体的相互作用。

尽管人们对纳米塑料的环境和生物影响日益关注，但现有研究多集中于理想实验室条件下的原始颗粒，未能反映其环境老化状态。在城市污水处理系统中，塑料颗粒经历高级氧化过程（如芬顿反应），其表面化学性质、氧化还原反应活性及生物相互作用会发生实质性改变。有研究指出，氧化处理后的纳米塑料可能更易穿透细胞膜，与细胞器结合，并在进入生物体后诱导氧化应激、线粒体功能障碍、免疫激活甚至神经毒性。然而，这些与环境相关的转化所产生的毒理学后果，尤其在分子水平上，仍待深入探索。此外，先前研究主要侧重于机体或细胞表型，对老化塑料颗粒诱导的蛋白质组学改变的机制见解有限。

为填补上述空白，本研究选取聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）作为典型模型污染物，模拟其在污水处理中的芬顿氧化过程，构建了芬顿处理的PS-NPs。通过体外细胞模型（MN9D多巴胺能神经元细胞）和体内动物模型（秀丽隐杆线虫，Caenorhabditis elegans）的双重系统，从行为、细胞功能及生理毒性等多方面系统评估了纳米塑料在芬顿处理前后的毒性变化。同时，进一步结合高通量定量蛋白质组学分析，深入研究了线虫暴露于不同处理条件下PS-NPs后蛋白质表达谱及相关信号通路的变化，旨在阐明纳米塑料经AOPs处理后的生物学机制及潜在分子靶点。该工作为理解环境老化的纳米塑料如何比其原始对应物产生更大生物影响提供了新的机制见解，并为城市污水中纳米塑料污染的风险评估和控制策略提供了科学依据和新思路。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过芬顿氧化模拟污水处理过程制备老化纳米塑料；利用扫描电子显微镜（SEM）、动态光散射（DLS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征颗粒理化性质；采用CCK-8法和DCFH-DA荧光探针分别评估MN9D细胞活力和细胞内活性氧（ROS）水平；以野生型秀丽隐杆线虫（N2）为模型，观察其运动行为（头部摆动和身体弯曲）、体长发育及衰老标志物（脂褐素）积累；并运用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）进行定量蛋白质组学分析，结合生物信息学方法（如GO/KEGG富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用网络构建）阐释差异表达蛋白的功能及通路。

3.1. PS-NPs的表征

通过扫描电子显微镜（SEM）、动态光散射（DLS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）等技术对原始和芬顿处理的PS-NPs的形貌、粒径、表面电荷和化学组成进行了分析。结果显示，芬顿处理后PS-NPs表面粗糙度增加，流体动力学直径减小（从264.80±17.35 nm降至201.40±3.58 nm），Zeta电位更负（从-0.76±0.66 mV变为-12.17±0.72 mV），表明分散性增强。FTIR光谱显示O-H（3444 cm^-1）和C-O（1028 cm^-1）吸收峰强度增加，证实表面氧化程度加深，生成了醇或酚类等含氧极性官能团。

3.2. PS-NPs对MN9D细胞的细胞毒性

采用CCK-8法检测细胞活力发现，原始和芬顿处理的PS-NPs在50、100和200 μg/mL浓度下均显著降低MN9D细胞活力，且原始PS-NPs的抑制效应更强（在100 μg/mL时活力降低56.17%，而芬顿处理组为23.42%）。然而，通过DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平发现，芬顿处理的PS-NPs在50 μg/mL浓度下诱导了更高的ROS生成，表明其引发更显著的氧化应激反应。

3.3. PS-NPs诱导的秀丽隐杆线虫生理变化

暴露于不同浓度（10、100、1000 μg/L）的PS-NPs 72小时后，评估线虫的运动行为（头部摆动和身体弯曲）和体长发育。结果表明，两种PS-NPs均呈剂量依赖性抑制线虫的运动能力和体长增长。值得注意的是，即使在低剂量（10 μg/L）下，芬顿处理的PS-NPs也显著抑制了线虫的头部摆动（降低48.12%）和身体弯曲（降低46.47%），并减短体长，而原始PS-NPs在10 μg/L时对体长无显著影响，说明芬顿处理增强了其发育毒性。

3.4. PS-NPs诱导的秀丽隐杆线虫生化变化

检测线虫体内脂褐素（衰老标志物）和ROS水平发现，暴露于100 μg/L的PS-NPs后，两种颗粒均引起脂褐素和ROS水平显著升高。其中，芬顿处理的PS-NPs诱导的脂褐素积累（增加20.10%）和ROS升高（增加11.93%）均高于原始PS-NPs（分别为12.12%和3.61%），进一步证实老化颗粒引发更强的氧化损伤和加速衰老效应。

3.5. PS-NPs诱导的秀丽隐杆线虫蛋白质组变化

通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术对暴露于不同剂量PS-NPs的线虫进行定量蛋白质组学分析。主成分分析（PCA）显示处理组与对照组在蛋白表达谱上明显分离，且呈剂量依赖性趋势。差异表达蛋白（DEPs）数量分析表明，原始PS-NPs在低、中、高剂量（10、100、1000 μg/L）下诱导的DEPs数量分别为80、25和141个，而芬顿处理的PS-NPs则分别为44、93和85个。值得注意的是，芬顿处理组在高剂量下DEPs绝大多数为下调表达（84个下调），提示高浓度老化颗粒可能抑制整体蛋白合成能力。

3.6. PS-NPs诱导的DEPs的GO/KEGG富集分析

基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，原始PS-NPs在低剂量主要影响碳代谢、氨基酸生物合成等基础代谢通路；中剂量富集于核糖体通路；高剂量则激活氧化磷酸化、碳代谢、核糖体和剪接体等多条通路，表明高浓度暴露导致能量代谢失衡和蛋白质稳态破坏。相比之下，芬顿处理的PS-NPs即使在低剂量也显著富集核糖体和碳代谢相关通路，中高剂量进一步涉及TCA循环、氧化磷酸化、细胞骨架重塑、染色质重塑和核质运输等通路，GO条目显示与翻译、能量生成、神经系统调节、免疫反应及寿命调控等功能密切相关，表明其毒性干扰更具多维性和系统性。

3.7. PS-NPs暴露下线虫DEPs的PPI网络

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析发现，原始PS-NPs诱导的网络随剂量增加从翻译调节（如延伸因子eef-1B.1/1B.2）转向蛋白降解和氧化应激反应（如hsp-6、prdx-3）。而芬顿处理的PS-NPs在所有剂量下均形成以核糖体蛋白（rpl/rps系列）和翻译因子为核心的高度连接网络，网络密度和复杂度随剂量增加而增大，表明其对翻译系统的干扰尤为显著。

本研究通过模拟城市污水处理中的芬顿氧化过程，系统揭示了纳米塑料老化转化后其理化性质与毒性效应的显著变化。芬顿处理使PS-NPs表面氧化程度加深，亲水性增强，分散性提高，进而改变了其与生物体系的相互作用模式。在毒性表现上，原始PS-NPs主要通过物理作用直接损伤细胞膜，导致更强的细胞活力抑制；而老化后的PS-NPs则因其表面官能团赋予的更高化学活性，更易诱导氧化应激，引发细胞内ROS水平升高，并在模式生物线虫中表现出更严重的运动行为障碍、发育抑制及衰老加速等表型。蛋白质组学证据进一步从分子层面阐明，老化PS-NPs能更广泛地扰动能量代谢、蛋白质翻译合成、细胞骨架功能乃至表观遗传调控等多个核心生物学过程，尤其对核糖体结构和功能造成了持续性干扰。这些发现强调了污水处理过程中高级氧化工艺在去除微塑料的同时，可能 inadvertently 产生表面改性、生物活性增强的"二次污染物"，其潜在生态风险不容忽视。该研究不仅深化了对环境老化微塑料毒性转化机制的理解，也为优化污水处理工艺、完善微塑料污染风险评估体系提供了重要的科学依据。