FoxA2上调诱导传代髓核细胞逆转为脊索样细胞：推动椎间盘退变再生治疗新策略

《npj Regenerative Medicine》：Reversion of passaged nucleus pulposus cells to notochordal-type cells by FoxA2 upregulation

　　本研究针对椎间盘退变治疗中脊索细胞来源稀缺的难题，通过CRISPR/dCas9基因编辑技术成功激活FoxA2表达，使传代髓核细胞逆转为具有脊索细胞表型的功能细胞。该研究证实工程化细胞在体外能形成更高品质的髓核组织，并在离体椎间盘损伤模型中展示存活与基质生成能力，为细胞疗法治疗椎间盘退变提供了创新性解决方案。

　　

椎间盘退变是导致慢性腰背痛的主要原因，全球有超过80%的人一生中会受其困扰。健康的椎间盘由髓核（NP）、纤维环（AF）和软骨终板组成，其中髓核核心区的脊索细胞（NC）在维持椎间盘稳态中起着关键作用。然而随着年龄增长，脊索细胞数量显著减少，且现有治疗方法如保守治疗、椎间盘切除术和脊柱融合术等都只能缓解症状，无法逆转退变进程。

在这项发表于《npj Regenerative Medicine》的研究中，研究团队发现传代培养的髓核细胞会逐渐丧失脊索细胞特征标记物（FoxA2、Brachyury和Noto）的表达。通过CRISPR/dCas9基因编辑技术特异性激活FoxA2表达，成功使传代髓核细胞逆转为具有脊索细胞表型的细胞。这些工程化细胞不仅表达脊索细胞特征蛋白（细胞角蛋白、CD24和SHH），还在体外形成更高品质的髓核组织，并在离体椎间盘损伤模型中展示出存活和基质生成能力。

研究采用的主要技术方法包括：从6-12月龄小牛尾椎分离原代髓核细胞；利用CRISPR/dCas9-SAM系统进行FoxA2基因编辑；通过膜插入式培养系统进行体外髓核组织生成；使用离体牛椎间盘针损伤模型评估细胞再生潜力。

转录因子在传代牛髓核细胞脊索细胞中的表达

研究发现，随着传代次数增加，髓核细胞中脊索细胞相关转录因子FoxA2、Brachyury（T）和Noto的基因和蛋白表达均显著下降。免疫染色显示，FoxA2阳性细胞从P0代的21.5%降至P1代的2.6%，表明脊索细胞在传代过程中快速丢失。

FoxA2转录因子瞬时过表达上调脊索细胞相关标记物

FoxA2瞬时过表达显著上调了脊索细胞标记物CK18、CD24和SHH的基因表达，且蛋白水平验证显示FoxA2和CK18表达在转染后24小时达到峰值。免疫染色证实FoxA2与CK18在细胞内共定位，而Brachyury和Noto的瞬时过表达则未能诱导脊索细胞标记物上调。

CRISPR/dCas9编辑NP细胞内源性FoxA2表达增强脊索细胞相关标记物表达

通过特异性sgRNA靶向FoxA2启动子区域，成功建立了稳定表达FoxA2的髓核细胞系。基因编辑细胞在P3代时显示FoxA2蛋白表达增加2.2倍，CK18蛋白表达增加1.7倍，且约70%的细胞表达FoxA2，50%表达CK18。这些细胞还表现出空泡化形态，这是脊索细胞的典型特征。

CRISPR/dCas9编辑细胞的体外NP组织生成

P5代基因编辑细胞在胶原II或纤连蛋白包被的膜插入物上培养14天后，形成的组织显示更高的细胞数量和蛋白聚糖含量。SgRNA-FoxA2组组织中54.6%的细胞表达FoxA2，32.2%表达细胞角蛋白，而对照组则无阳性细胞。

TGFβ3增强CRISPR/dCas9 FoxA2编辑细胞的体外NP组织形成

TGFβ3处理显著增强了基因编辑细胞的体外组织形成能力，组织更厚且积累了更多的II型胶原和聚集蛋白聚糖。然而，TGFβ3也降低了FoxA2阳性和细胞角蛋白阳性细胞的比例，提示其可能促进脊索样细胞向髓核细胞分化。

FoxA2-SgRNA编辑细胞在针损伤IVD模型中展示NP组织再生能力

在离体牛椎间盘针损伤模型中，注射SgRNA-FoxA2细胞的椎间盘显示部分再生特征，而对照组则出现组织缺损。组织学分析证实工程化细胞在损伤部位存活并产生II型胶原等基质分子。

研究证实FoxA2在脊索细胞表型维持中的核心地位，其激活可诱导传代髓核细胞逆转为功能性的脊索样细胞。虽然工程化细胞表型稳定性在传代后期有所下降，可能源于表观遗传调控或培养条件限制，但本研究建立的CRISPR/dCas9介导的FoxA2激活策略为椎间盘退变的细胞治疗提供了新途径。未来需在人类细胞和体内动物模型中进一步验证这一方法的再生潜力，推动其向临床转化。