CRISPR-Cas9 HDR优化新策略：RAD52、变性及5'-修饰DNA模板提升基因敲入小鼠构建效率

《iScience》：CRISPR-Cas9 HDR optimization: RAD52, denatured, and 5′-modified DNA templates in knock-in mice generation

　　本研究针对CRISPR-Cas9介导的同源定向修复(HDR)效率低下的难题，系统评估了DNA模板变性、RAD52蛋白辅助及5'-末端修饰等多种策略对Nup93条件性基因敲除(cKO)小鼠模型构建的影响。研究发现：变性单链DNA(ssDNA)模板可显著提升精确编辑效率并减少头尾串联重复；RAD52蛋白能使HDR效率提升近4倍；5'-生物素和5'-C3间隔基修饰可分别使单拷贝整合效率提升8倍和20倍。该研究为优化大片段基因敲入提供了切实可行的技术方案。

　　

在遗传工程领域，构建基因条件性敲除(cKO)小鼠模型一直是项复杂且耗时的挑战。虽然CRISPR-Cas9技术的出现为基因组编辑带来了革命性突破，但其同源定向修复(HDR)效率低下、供体DNA模板易形成串联重复等问题，严重制约了大型DNA片段精准整合的效率。特别是在构建需要在特定基因两侧引入LoxP位点的cKO模型时，研究人员往往需要面对低效的精确整合和高频率的模板多聚化并存的困境。

针对这一技术瓶颈，明斯特大学研究团队在《iScience》上发表了最新研究成果，系统性地探索了多种优化策略对HDR效率的影响。该研究以小鼠Nup93基因为靶点，通过向2000多个受精卵中注射CRISPR-Cas9组件，成功获得了270只奠基小鼠，为评估不同编辑策略提供了丰富的数据支持。

研究采用了几项关键技术方法：通过电脉冲诱导显微注射技术将编辑组件导入小鼠受精卵；利用Southern blot分析和qPCR技术对F0代小鼠进行基因型鉴定；比较了双链DNA(dsDNA)和热变性单链DNA(ssDNA)模板的效率差异；评估了RAD52重组蛋白的辅助作用；并测试了5'-生物素和5'-C3间隔基修饰对模板稳定性和整合效率的影响。

Nup93基因靶向策略的设计与应用

研究团队选择小鼠Nup93基因作为靶点，该基因编码核孔复合体的关键组分，对胚胎发育至关重要。研究人员设计了一种一步法策略，通过CRISPR-Cas9复合物和含有两个LoxP位点的长供体DNA模板直接注射到受精卵中，依赖细胞自身的HDR机制实现精准编辑。

供体DNA模板长约600bp，包含被LoxP位点包围的外显子-内含子区域以及短的60nt和58nt同源臂。为便于通过Southern blot分析检测单拷贝整合，研究人员在引入的LoxP序列附近加入了EcoRI和BamHI限制性内切酶识别位点。同时，针对侧翼区域设计了两对重叠的crRNA(CRISPR RNA)，分别靶向互补DNA链。

变性DNA模板对HDR的增强效应

初步实验使用靶向反义链的crRNA1和靶向正义链的crRNA7组合，与dsDNA模板共同注射。结果显示，在47只出生的幼鼠中，仅有1只(2%)表现出正确靶向的等位基因，而16只(34%)存在供体DNA模板的头尾串联整合。当使用变性DNA模板后，正确靶向动物的比例增加了近4倍(8%)，模板多聚化减少了近2倍(17%)。

引人注目的是，当在注射混合物中加入人源RAD52蛋白后，26%的动物携带精确HDR靶向的基因座，比单独使用ssDNA提高了3倍以上，比dsDNA提高了13倍。然而，这种改进也伴随着模板多聚化增加近2倍(30%)，表明RAD52在促进HDR的同时也可能加剧了模板的串联重复。

crRNA链特异性对HDR整合的影响

研究人员评估了不同crRNA组合对变性供体DNA模板整合效率的影响。当使用靶向反义链的crRNA1和crRNA8组合时，检测到HDR介导的精确插入增加了近2.5倍。相反，靶向正义链的crRNA2和crRNA7组合导致基因座修饰总体频率增加到72%，但这一增加主要由异常模板整合(56%)驱动，仅有6%的动物显示正确的基因座靶向。

这些发现表明，crRNA链的选择可能影响HDR效率，并可能影响变性供体模板在CRISPR-Cas9介导的靶向过程中的完整性。靶向反义链(特别是在转录活跃的基因中)可增强精确的HDR介导插入，而正义链靶向虽然增加了总体修饰率，但导致更高频率的异常整合。

5'-末端修饰对基因组编辑精度的影响

为进一步优化基因组编辑方案，研究团队测试了5'-末端修饰的供体DNA模板。使用5'-生物素化dsDNA供体模板时，HDR介导的精确基因座修饰增加了近7倍，达到14%，而头尾插入减少了近7倍，仅发生在5%的修饰动物中。

更为显著的是，应用含有5'-末端C3间隔基修饰的供体dsDNA模板导致HDR介导的插入大幅增加近20倍，40%的修饰动物携带正确的基因座修饰。总体基因座修饰率达到约80%，与使用变性DNA模板结合RAD52蛋白观察到的比率相当。5'-末端C3间隔基修饰的供体模板变性后，与未变性模板相比没有显著差异，但头尾串联插入略有减少(5%)。

讨论与展望

本研究系统评估了多种优化CRISPR-Cas9介导HDR效率的策略。热变性DNA模板的使用显著提高了精确基因组修饰的效率，同时减少了不必要的串联重复。变性模板的主要优势在于其完整的序列保真度，因为它们直接来自经过验证的dsDNA，确保了无合成诱导错误。

RAD52补充作为HDR效率的有效增强剂，但其使用应仔细权衡，以防增加模板多聚化。此外，5'-生物素化和5'-C3间隔基修饰为提高HDR为基础的基因组编辑提供了有前景的策略。生物素化有效减少模板串联，而C3间隔基修饰在保持精确基因组整合的同时，显著提高了HDR效率。

特别值得注意的是，靶向转录活跃链(反义链)可显著提高HDR介导的精确编辑效率，这为优化精确基因组编辑策略提供了宝贵见解，特别是对于在早期胚胎发育期间转录活跃的基因。

尽管本研究在单一基因组位点进行，但通过精心控制实验条件，每次只修改一个参数，能够精确评估每种修饰对HDR效率和总体基因座靶向的直接影响。这些发现为改进CRISPR-Cas9介导的基因组编辑策略提供了重要指导，最终有助于在哺乳动物模型中实现更高效、更精确的遗传修饰。

研究局限性方面，使用5'-修饰模板可能存在合成错误的风险，可能引入意外的序列变异。研究人员需要在高效HDR效率与存在错误风险之间取得平衡，或者优先考虑绝对的序列完整性而可能以降低效率为代价。未来研究应调查这些修饰的组合效应及其与其他HDR增强因子的相互作用，以进一步完善基因组编辑策略。