综述：CRISPR技术在病原体检测中的应用进展：基于扩增与免扩增策略

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Advances in the application of CRISPR technology in pathogen detection: amplification-based and amplification-free strategies

　　这篇综述系统阐述了CRISPR（簇规律间隔短回文重复序列）技术在病原体检测领域的最新进展，重点对比了基于扩增（如结合RPA/LAMP等温扩增）与免扩增（级联CRISPR、传感器技术、数字液滴CRISPR）两类策略的原理与性能。文章深入分析了该技术在病毒（SARS-CoV-2、HPV等）、细菌（结核分枝杆菌、MRSA等）及真菌寄生虫检测中的临床应用，并探讨了其灵敏度、特异性、操作便捷性等优势与局限，为病原体快速诊断技术的优化提供了重要理论参考。

　　

1 引言

在病原体检测领域，微生物培养作为实验室检测的"金标准"虽能确定微生物活性，但耗时长达2-10天，且对技术要求和生物安全防护要求高。免疫检测中抗原检测主要用于感染早期，而抗体检测在感染初期阳性率较低（约27%-41%）。传统PCR技术（如qPCR）灵敏度高但检测时间长，对设备人员要求严苛。近年来，等温扩增技术（RPA、LAMP等）虽消除了对热循环的依赖，但存在非特异性扩增等问题。CRISPR系统及其相关Cas蛋白的出现为分子诊断带来了革新。自1987年发现以来，CRISPR被确认为细菌的适应性免疫机制，其通过crRNA引导识别特定核酸序列实现病原检测。CRISPR系统主要分为六型，其中II、V和VI型在基因编辑和病原检测中应用最广。

2 CRISPR免疫激活切割原理

CRISPR系统以其卓越的特异性和灵活性，在各种生物体中实现精确基因编辑。以Cas9为例，其免疫激活机制包含外源基因片段插入、crRNA引导复合物形成、靶向切割等步骤。关键特性在于Cas蛋白在特异性切割后展现非特异性切割活性：Cas9、Cas12a、Cas14（Cas12f）切割单链DNA（ssDNA），Cas13切割单链RNA（ssRNA），这一现象称为反式切割活性。研究人员利用该原理开发CRISPR体外诊断技术，通过设计特异性crRNA引导CRISPR复合物结合靶标，切割带有荧光信号（FAM、ROX等）和淬灭基团（BHQ）的报告分子实现检测。侧流层析试纸条（LFA）技术的引入进一步拓展了CRISPR在即时检测（POCT）中的应用潜力。

2.1 CRISPR检测分类

根据应用方法，CRISPR技术主要分为基于扩增的CRISPR和免扩增CRISPR两大类。基于扩增的策略通过RPA、LAMP、多重交叉置换扩增（MCDA）等核酸扩增技术提升检测灵敏度，如RPA与CRISPR-Cas12a结合可在30分钟内实现Mpox病毒DNA的检测，灵敏度达1拷贝。免扩增策略则直接检测病原体，减少操作步骤，如CRISPR-Cas13a系统可直接结合RNA靶标产生信号，在HIV-1病毒检测中展现良好性能。

2.2 基于扩增的CRISPR检测原理

2.2.1 两步法检测

典型代表SHERLOCK技术聚焦CRISPR-Cas13系统，通过RPA扩增和T7介导的逆转录转录激活系统，在临床样本中展现100%灵敏度和特异性。DETECTR技术基于CRISPR-Cas12系统，主要用于DNA检测。但两步法需人工转移扩增产物，增加操作复杂性和气溶胶污染风险。

2.2.2 一锅法检测

通过物理分隔（双层反应管、离心混合设计）或反应条件优化（动态水相多相反应系统DAMR）实现扩增与CRISPR反应整合。例如，利用石蜡分隔RAA和CRISPR-Cas12a系统，灵敏度达2.5×10⁰拷贝/μL。温度兼容性策略如LAMP与Cas12b（58°C）组合，以及亚优化PAM（VTTV、TCTV等）的应用，有效降低Cas12a顺式切割活性。光控一锅法通过光裂解连接子调控crRNA活性，为一体化检测提供新思路。

2.3 免扩增CRISPR检测原理

2.3.1 级联CRISPR检测

通过多crRNA策略（灵敏度提升6-64倍）或核酸电路信号放大（如U富集发夹结构URH、双链激活循环DSAC系统）增强信号。例如，Cas12a介导的级联切割增强方法（TCC）可在40分钟内检测低至1.2 CFU/mL的病原体。但级联策略存在crRNA设计复杂和假阳性风险。

2.3.2 传感器结合CRISPR检测

石墨烯场效应晶体管（gFET）通过Cas13a切割PolyU20报告分子引起电荷中性点电压（V_CNP）变化，实现aM级检测；电化学生物传感器（ECL）利用亚甲蓝（MB）或二茂铁（Fc）氧化还原信号检测HPV、SARS-CoV-2等病原；表面增强拉曼散射（SERS）技术通过纳米颗粒信号变化实现1 fM灵敏度检测。各类传感器在成本、稳定性和操作复杂性上各有特点，未来材料科学进步将推动其实际应用。

2.3.3 数字液滴CRISPR检测

通过微滴技术实现单分子水平定量，如STAMP数字CRISPR-Cas13a检测HIV-1 RNA灵敏度达2000拷贝/mL。简单涡旋生成10-100 μm油相微滴的方法降低设备依赖，适合资源有限环境下的POCT应用。

3 CRISPR在人类病原体检测中的应用

3.1 病毒病原体

3.1.1 RNA病毒

STOPCovid.v1整合磁珠提取、LAMP和LFA，1小时内检测SARS-CoV-2（灵敏度93.1%）；三crRNA免扩增CRISPR-Cas13a系统结合手机显微镜实现30拷贝/μL灵敏度；SATORI自动化数字液滴平台9分钟检测SARS-CoV-2和流感病毒；Cas-Roller方法可检测埃博拉病毒至291 aM。

3.1.2 DNA病毒

CRISPR-Cas12a系统用于HPV分型检测（灵敏度1拷贝/μL）和HBV检测（SERS法灵敏度0.67 pM）；Cas14a级联比色法可区分2-nt差异的ASFV变异株。值得注意的是，Cas13检测DNA需通过T7转录将DNA转化为RNA。

3.2 细菌病原体

CRISPR-MCDA技术70分钟检测结核分枝杆菌（灵敏度5 fg/μL）；免扩增ECL检测MRSA的mecA基因；多信号输出CPF-CRISPR生物传感器实现MRSA多模式检测；OR门控逻辑的级联正反馈系统可同步检测MSSA、MRSA、大肠杆菌和HBV，显著降低成本。

3.3 其他病原体

针对白色念珠菌的检测灵敏度达30 CFU/mL；CRISPR-Cas12技术20分钟鉴定疟原虫种类；CRAFT平台整合核酸提取、RPA和CRISPR反应，实现肺炎支原体快速检测。

4 讨论

基于扩增的策略灵敏度高（可达1拷贝/μL），但存在污染风险；免扩增策略特异性更优，检测时间可缩短至5分钟。目前基于扩增的方法已广泛应用，而免扩增策略在真菌、寄生虫等检测中尚处探索阶段。临床应用中，样本基质复杂性、设备集成和结果标准化仍是挑战。成本方面：基于扩增策略每个检测试剂成本约0.84美元，免扩增策略虽节省试剂但设备投入较高。未来发展方向包括简化样本前处理、提高设备便携性/自动化、实现多重检测。微流控技术与CRISPR的结合，以及便携设备（如温度计集成平台）和全自动数字液滴系统（SATORI）的发展，将推动该技术在POCT和资源有限场景中的应用。