GAPDH的RNA结合机制调控急性髓系白血病中的转录本稳定性及蛋白质翻译过程

《RNA Biology》：RNA binding of GAPDH controls transcript stability and protein translation in acute myeloid leukemia

　　本研究利用CRISPR/Cas9筛选和CLIP结合RNA测序，发现非经典RNA结合蛋白GAPDH在急性髓性白血病（AML）细胞增殖中起关键作用。GAPDH通过稳定自身mRNA及靶基因（如TNFα、MYC、RPL13a）的mRNA，影响翻译效率和代谢途径，并表现出核内调控功能。抑制GAPDH可显著降低细胞存活率，且其RNA结合能力对代谢条件敏感。这些发现为靶向GAPDH的AML治疗提供了新思路。

　　RNA结合蛋白（RBPs）在癌症细胞中表现出异常调控，是癌症发生的重要标志之一。其中，在急性髓系白血病（AML）中，RBPs作为关键调控因子，影响肿瘤细胞的增殖和存活。尽管传统的RBPs具有明确的RNA结合结构域（RBD），但非经典RBPs（ncRBPs）在AML中的RNA识别和功能仍存在许多未知。为了探索这些ncRBPs在AML中的作用，研究团队利用基于CRISPR/Cas9的筛选技术，寻找对AML细胞生存至关重要的ncRBP候选分子。研究发现，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为一种糖酵解酶，在AML细胞中表现出促进增殖的特性。结合交叉链接和免疫沉淀（CLIP）技术，研究者进一步定义了GAPDH的全球RNA靶点图谱，发现其主要结合在mRNA的5’UTR区域，包括GAPDH自身mRNA、60S核糖体蛋白L13a（RPL13a）和丙酮酸激酶（PKM）。GAPDH的敲低揭示了与核糖体生物合成、翻译起始和调控相关的遗传通路。此外，研究还发现GAPDH通过与靶基因mRNA结合，对其稳定性产生影响。这些发现为理解GAPDH在AML中的RNA功能和特性提供了新的视角。

在AML中，GAPDH的表达水平与疾病进展密切相关。该研究指出，GAPDH不仅在糖酵解中发挥关键作用，还具有多种“moonlighting”功能，包括膜融合、DNA修复与复制、铁代谢调节以及细胞死亡调控。值得注意的是，GAPDH还被报道为一种非经典RNA结合蛋白，能够与富含腺嘌呤-尿嘧啶（ARE）的RNA序列结合，如癌基因MYC和炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）。研究假设GAPDH通过四聚体结构与靶标RNA结合，利用其NAD+结合区域的Rossmann折叠或单体界面的正电荷沟槽实现这一功能。基于突变分析，研究提出了一种模型，认为GAPDH通过序列依赖的方式结合靶标TNFα-ARE，这一过程涉及其二聚体和四聚体界面。然而，具体的RNA结合区域仍需进一步研究。

为了更深入地揭示GAPDH在AML中的作用，研究团队进行了系统性的RNA结合分析，采用CLIP和RNA-seq技术，分析了GAPDH在不同代谢条件下的RNA靶点图谱。结果显示，GAPDH在不同代谢状态下结合的RNA靶点存在一定的多样性，但其结合的潜在序列特征保持一致。这种序列特异性可能意味着GAPDH并非以一种固定的模式与RNA相互作用，而是依赖于特定的RNA结构和细胞环境。进一步分析表明，GAPDH的结合偏好主要集中在mRNA的5’UTR区域，这一发现与以往关于GAPDH结合于3’UTR的研究有所不同，也说明其在RNA稳定性及翻译调控中的潜在作用。

通过分析不同代谢条件下的RNA结合情况，研究团队发现GAPDH在不同代谢环境下对RNA结合的影响具有一定的差异。例如，在低葡萄糖或使用半乳糖替代葡萄糖的条件下，GAPDH对RNA的结合能力略有下降，这可能与细胞代谢状态的变化有关。然而，整体来看，GAPDH对RNA的结合能力在所有代谢条件下均表现出一定的稳定性和特异性。研究还通过荧光偏振实验和电泳迁移率实验（EMSA）验证了GAPDH与RNA靶点的结合特性，结果显示GAPDH与TNFα-ARE具有较高的结合亲和力，其解离常数（Kd）分别为217 nM和167 nM，表明其对特定RNA序列具有较强的识别能力。此外，研究团队还发现GAPDH与自身mRNA的结合，这一现象可能表明GAPDH具有自我调控的功能，类似于许多经典RBPs的“RBP egocentrism”特性。

研究进一步探讨了GAPDH对RNA稳定性的影响。通过使用Actinomycin D进行RNA稳定性实验，发现GAPDH的敲低显著缩短了其自身mRNA的半衰期，表明其在维持mRNA稳定性方面具有重要作用。此外，GAPDH还对其他靶标mRNA（如MYC、TNFα和PKM）表现出一定的稳定作用，而对照mRNA（如β-actin）则未受到影响。这些结果表明，GAPDH可能通过结合特定RNA序列，调控其稳定性，从而影响蛋白质合成和细胞功能。

研究团队还分析了GAPDH对蛋白质翻译的影响。通过检测与GAPDH结合的RNA靶点在不同代谢条件下的翻译效率，发现GAPDH的缺失导致部分靶标mRNA的翻译增加，这可能表明其在调控翻译过程中的作用。然而，这一调控并非普遍发生，而是具有高度的转录本和细胞环境依赖性。此外，研究还发现GAPDH的敲低影响了与染色质重塑相关的基因表达，进一步揭示了其在细胞核中的“moonlighting”功能，可能通过调控染色质结构和基因表达来影响AML细胞的增殖。

在分析GAPDH的RNA结合特性时，研究团队还发现了一些新的RNA靶点，如GAPDH自身的5’UTR、RPL13a的5’UTR和PKM。这些发现不仅扩展了我们对GAPDH作为ncRBP功能的理解，也为未来探索GAPDH在AML及其他癌症中的调控机制提供了新的线索。此外，研究还发现GAPDH的结合能力可能受到其代谢功能的影响，例如其活性形式（四聚体）与RNA的结合可能受到NAD+结合区域的调控。

研究还探讨了GAPDH在不同代谢条件下的功能差异。例如，在低葡萄糖或半乳糖条件下，GAPDH对RNA的结合能力有所下降，这可能与细胞代谢途径的改变有关。然而，这些变化并未显著影响GAPDH的整体RNA结合能力，说明其RNA结合功能具有一定的鲁棒性。此外，研究团队还发现，GAPDH的RNA结合能力可能受到特定抑制剂的影响，例如heptelidic acid（HA），该抑制剂通过修饰GAPDH的半胱氨酸残基，间接影响其RNA结合能力。这表明GAPDH的RNA结合功能可能与其代谢活性存在一定的联系，或者通过不同的结构域相互作用。

总体而言，该研究揭示了GAPDH在AML细胞中的多重功能，不仅作为糖酵解的关键酶，还在RNA结合和翻译调控中发挥重要作用。通过CRISPR/Cas9筛选和CLIP分析，研究团队成功识别了GAPDH的RNA靶点，并进一步验证了其对RNA稳定性和翻译效率的影响。这些发现为理解GAPDH在AML中的调控机制提供了重要的依据，也为开发针对GAPDH的新型治疗策略提供了理论支持。未来的研究需要进一步探索GAPDH的RNA结合区域及其与代谢功能之间的关系，以更全面地揭示其在癌症中的作用机制。