成像非重复性内源基因位点DNA损伤应答时间进程的新方法

《Cell Reports Methods》：Imaging the time course of DNA damage response at a nonrepetitive endogenous locus

　　本刊推荐：为克服现有方法在基因组背景、时间控制和细胞异质性解析上的局限，Rybczynski等人开发了结合超快CRISPR(vfCRISPR)、局部基因组变性荧光原位杂交(GOLDFISH)和免疫荧光(IF)的串行固定技术，实现了在任意基因组位点以分钟级分辨率追踪53BP1、γH2AX、BRCA1等修复因子动态及染色质解压缩过程，为基因组不稳定性相关疾病研究提供了强大工具。

　　

当DNA双链断裂(DSB)这种最严重的DNA损伤形式发生时，细胞会启动复杂的修复机制。理解这些修复过程的动态变化对研究基因组完整性、细胞存活和疾病机制至关重要。然而，传统研究DSB修复动力学的方法存在明显局限：它们往往受限于特定的基因组环境、时间控制不够精确，或者无法解析细胞间的异质性。更具体地说，当前的方法难以在任意基因组位点，以匹配DSB修复快速性（秒到分钟级）的时间分辨率，来同时观察修复因子聚集和染色质结构变化。

为了解决这些挑战，由Taekjip Ha领导的团队在《Cell Reports Methods》上发表了一项研究，介绍了一种创新的方法，能够以高时空分辨率追踪特定基因组位点的DNA修复进程。该方法的核心在于将三种技术巧妙结合：超快CRISPR (vfCRISPR) 用于在秒级时间尺度上诱导同步的DNA双链断裂；基因组寡核苷酸绘画 via 局部变性荧光原位杂交 (GOLDFISH) 用于标记特定的非重复性内源基因位点；以及免疫荧光(IF)用于检测DNA损伤应答蛋白。尤为关键的是，研究人员开发了一种串行有机固定方案(M2MA)，成功解决了传统GOLDFISH固定方法会导致某些关键核蛋白（如组蛋白相关标记γH2AX）丢失的问题，从而实现了修复因子信号与特定基因位点标记的同时、可靠检测。

研究人员为开展此项研究，主要应用了几项关键技术：1）超快CRISPR (vfCRISPR)：通过光激活预结合在目标位点的“笼蔽”引导RNA，在秒级时间内同步诱导特定基因组位点（如ACTB基因）的DNA双链断裂。2）改进的GOLDFISH技术：利用Cas9切口酶和超螺旋酶Rep-X在固定细胞中对目标基因组区域（如ACTB基因座7.2 kb区域）进行局部变性，并使用荧光标记的探针进行标记，避免了传统FISH的全局变性，更好地保留了染色质结构。3）串行固定免疫荧光(M2MA)：先使用甲醇(M100)固定细胞并进行免疫荧光标记（检测53BP1、γH2AX、BRCA1等蛋白），随后再用甲醇:乙酸(MAA)进行二次固定，之后进行GOLDFISH实验。这种方案既保留了蛋白抗原性用于IF，又满足了GOLDFISH对染色质可及性的要求。研究使用的细胞系包括人骨肉瘤细胞(U2OS)、人胚胎肾细胞(HEK293T)和正常人视网膜色素上皮细胞(RPE1)。

ACTB E2位点的GOLDFISH标记

研究首先针对β-肌动蛋白(ACTB)基因的第2个外显子(ACTB E2)设计GOLDFISH标记系统。他们设计了22条引导RNA(gRNA)和75条荧光标记的探针，靶向位于vfCRISPR诱导的DSB位点上游约6 kb处的一段7.2 kb区域。这种多gRNA设计确保了Rep-X超螺旋酶能在多个位点加载，提高标记效率。实验结果显示，在U2OS细胞中，GOLDFISH成功标记了ACTB位点，平均每个细胞检测到3.4个ACTB焦点，信噪比(S/B)足够高，便于可靠检测。缺乏Cas9切口酶或Rep-X时则无标记信号，证实了标记的特异性。

53BP1在Cas9介导的DSB位点的招募时间进程

应用vfCRISPR在ACTB E2位点诱导DSB后，研究人员在光照激活30分钟后固定细胞，通过IF检测53BP1（一种广泛使用的DSB修复标记物），并同时进行GOLDFISH标记ACTB位点。他们发现，与未光照对照相比，与ACTB位点共定位的53BP1焦点数量在DSB诱导后显著增加，而细胞核内53BP1焦点总数没有显著变化，这突出了位点特异性标记对于准确定量修复因子招募的重要性。Sanger测序证实，只有在光照样品中才在ACTB位点检测到插入/缺失(Indel)形成。

串行有机固定保留了对酸敏感的核蛋白信号用于兼容IF的GOLDFISH

DNA损伤应答涉及大量检测、信号传导和修复DNA损伤的蛋白。组蛋白变体H2AX的磷酸化(γH2AX)是DSB信号传导的关键事件。然而，最初用于GOLDFISH的甲醇:乙酸(MAA)固定法会提取带正电荷的核蛋白如组蛋白，导致γH2AX和BRCA1等修复标记物的IF检测失败。为了解决这个问题，研究团队测试了不同的有机固定剂和串行固定策略。他们发现，先用100%甲醇(M100)固定细胞，进行IF标记，再用MAA进行后固定（称为M2MA方案），能够很好地保留H2B、53BP1和γH2AX的核内定位和焦点信号，其信号背景比(S/B)与单独M100固定相当，且能再现53BP1和γH2AX的共定位模式。最终，他们成功地在同一批样品中同时检测到53BP1、γH2AX的IF信号和ACTB的GOLDFISH信号。

γH2AX和53BP1在单个DSB位点聚集的时间进程

利用优化后的M2MA固定策略，研究人员测量了在vfCRISPR诱导ACTB位点DSB后5、15和30分钟时，γH2AX和53BP1的聚集情况。结果显示，与ACTB位点共定位的γH2AX焦点比例在5分钟时就增加了10倍，并在15和30分钟时进一步增加至约35倍，表明γH2AX信号的传播发生在DSB后的前5-15分钟内。而与ACTB位点共定位的53BP1焦点比例在5分钟时没有显著变化，但在15和30分钟时分别增加了2倍和2.5倍，这表明53BP1的招募相对于γH2AX有所延迟，与之前观察到的约10分钟的招募动力学一致。此外，同时含有γH2AX、53BP1和ACTB信号的细胞中，与两者都共定位的ACTB位点比例在15和30分钟时显著增加。研究人员还测量了修复焦点的大小，发现53BP1和γH2AX焦点在ACTB位点的平均面积在15和30分钟时均有所增加，这可能与53BP1在DSB位点的寡聚化或γH2AX的传播有关。

单个DSB位点染色质解压缩的时间进程

通过测量GOLDFISH标记的ACTB焦点面积，研究人员将其作为DNA损伤后染色质解压缩的指标。虽然所有ACTB焦点的平均面积在不同时间点没有显著变化，但与γH2AX和53BP1都共定位的那部分ACTB焦点在30分钟时的面积比未光照对照增加了20%，支持了持续DNA损伤后发生的染色质解压缩。在另一个使用常规Cas9（非vfCRISPR）靶向ACTB的实验中，观察到在损伤后3小时，ACTB焦点面积增加了34%，进一步表明DSB位点发生了染色质解压缩。在更晚的时间点（如6、12、24、48小时），ACTB焦点大小恢复到与未损伤对照相似的水平，提示初始DSB可能早在6小时内就已修复，但持续的Cas9活性可能导致异质性修复。

BRCA1和53BP1在单个DSB位点聚集的时间进程

非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)是修复DSB的两条主要途径。53BP1促进NHEJ，而BRCA1促进HR。研究人员在DSB诱导后30分钟和3小时，检测了53BP1和BRCA1在ACTB位点的招募。他们在非同步化的细胞中观察到了细胞间的异质性：有些细胞只显示53BP1焦点，有些只显示BRCA1焦点，有些则两者都有或都没有。当将细胞同步在G1期或S/G2期时，G1期细胞主要表现为53BP1焦点招募到ACTB位点，而BRCA1招募显著减少；S/G2期细胞则显示BRCA1招募到ACTB位点的比例增加，而53BP1招募减少。这符合HR主要发生在细胞周期S/G2期的特征。此外，该方法在正常人视网膜色素上皮细胞(RPE1)和靶向另一个非重复内源位点MUC4时也得到验证，显示了该工作流程在不同细胞类型和基因组位点的适用性。

研究结论与意义

本研究成功地将vfCRISPR、GOLDFISH和免疫荧光技术整合在一起，建立了一个强大的研究平台，用于在任意基因组位点以高时空分辨率可视化DNA修复动力学。其重要意义在于：

1. 1.
   方法学创新：开发的串行固定协议(M2MA)成功解决了Cas9介导的成像技术与免疫荧光检测修复蛋白之间的兼容性问题，特别是保留了对固定敏感的组蛋白修饰（如γH2AX）的检测能力。
2. 2.
   高时空分辨率：vfCRISPR提供了秒级的损伤诱导同步性，结合GOLDFISH的位点特异性标记和IF的蛋白检测，使得在分钟时间尺度上解析修复因子的招募顺序和动力学成为可能，这是传统群体水平测序方法或活细胞成像（依赖重复序列或报告基因）难以实现的。
3. 3.
   揭示生物学过程：研究定量展示了γH2AX快速传播（5分钟内）以及53BP1相对延迟招募（10分钟以上）的动力学，验证了已知的DSB应答通路。同时，通过分析GOLDFISH焦点面积，为DNA损伤位点局部染色质解压缩提供了直观证据。
4. 4.
   广泛应用潜力：该方法适用于不同的细胞系（U2OS, RPE1）和基因组位点（ACTB, MUC4），并能够通过细胞周期同步研究修复通路选择（NHEJ vs. HR）的细胞周期依赖性，为在更真实的基因组环境下研究DNA修复机制打开了大门。

当然，该研究也存在一些局限性，例如未使用交联固定剂可能对某些微弱或瞬时的蛋白-DNA相互作用的定位分辨率有影响，vfCRISPR在原代细胞和组织中的验证与应用仍是未来的挑战。尽管如此，这项技术为深入研究基因组不稳定性、癌症发生发展以及相关疾病的机制提供了强有力的新工具，预计将在染色质生物学和DNA损伤修复领域产生广泛影响。