Caspase激活后发生的继发性坏死可能与Gasdermin E无关

《Advanced Science》：Secondary Necrosis Following Caspase-Activation can Occur Independently of Gasdermin E

　　本研究通过白喉毒素（DT）诱导的细胞死亡和Jo2抗体诱导的小鼠肝坏死模型，探讨次级坏死中气孔蛋白E（GSDME）的作用。实验发现，GSDME切割与DT或Jo2诱导的次级坏死无关，CRISPR/Cas9敲除GSDME不影响细胞死亡进程，且caspase抑制剂能有效阻止DT诱导的坏死。结论提示GSDME不参与次级坏死机制，而caspase抑制可能为治疗提供新思路。

　　细胞死亡是生物体维持组织稳态和防御有害刺激的重要过程，其机制研究对于理解疾病发生发展以及开发新的治疗策略具有重要意义。在细胞生物学中，细胞死亡主要分为几种类型，包括凋亡（apoptosis）、程序性坏死（necroptosis）和焦亡（pyroptosis），它们各自具有不同的分子机制和生物学功能。此外，还有一种被称为“继发性坏死”（secondary necrosis）的现象，它通常被认为是凋亡的后续阶段，而非直接由凋亡触发。然而，继发性坏死的具体机制仍然存在许多未解之谜，尤其是其是否依赖特定的分子途径，如gasdermin E（GSDME）的裂解。

本研究旨在探讨继发性坏死是否依赖GSDME的裂解。为此，研究者利用了多种实验模型，包括diphtheria toxin（DT）诱导的细胞死亡、cisplatin诱导的细胞死亡以及anti-Fas单克隆抗体Jo2诱导的小鼠急性肝毒性模型。通过这些模型，研究团队希望验证GSDME是否在继发性坏死过程中发挥核心作用。

DT是一种能够特异性抑制蛋白质合成的毒素，它通过修饰eukaryotic elongation factor 2（eEF2）上的diphthamide基团，导致细胞死亡。早期研究曾提出DT诱导的细胞死亡与凋亡相关，并认为其后续的细胞裂解（即继发性坏死）依赖于GSDME的裂解。然而，近年来的某些研究却表明，GSDME的裂解可能在继发性坏死中扮演重要角色。因此，本研究试图进一步验证这一假设。

在细胞实验中，研究团队首先观察了DT处理后的HeLa细胞。通过时间延时显微镜成像和流式细胞术，他们发现DT诱导的细胞死亡具有典型的凋亡特征，如细胞肿胀、膜泡化以及细胞死亡的延迟发生。进一步分析显示，DT处理后GSDME发生了显著的裂解，但当使用CRISPR/Cas9技术敲除GSDME后，DT诱导的继发性坏死并未受到影响。这意味着，尽管GSDME在DT诱导的细胞死亡过程中被裂解，但它并非继发性坏死所必需的分子。

此外，研究团队还评估了cisplatin诱导的细胞死亡。cisplatin是一种常用的化疗药物，其作用机制涉及DNA损伤并最终导致细胞死亡。在cisplatin处理后，同样观察到了GSDME的裂解，但当GSDME被敲除后，细胞死亡仍如常发生，说明GSDME的裂解可能并不是继发性坏死的关键步骤。为了进一步验证这一结论，研究者还利用了etoposide诱导的细胞死亡模型，该模型也显示出GSDME的裂解，但敲除GSDME并未改变细胞死亡的进程。

在动物模型方面，研究团队使用Jo2抗体诱导小鼠急性肝毒性，这是一种经典的继发性坏死研究模型。Jo2是一种能够激活Fas受体的单克隆抗体，诱导细胞凋亡并最终导致肝组织坏死。通过该模型，研究者观察到小鼠在注射Jo2后很快出现死亡，且肝组织中GSDME的裂解并未显著增加。这表明，在这一模型中，GSDME的裂解并非继发性坏死所必需。进一步的实验中，研究团队通过基因敲除技术构建了GSDME缺失的小鼠，并发现这些小鼠在Jo2诱导的肝毒性模型中同样表现出严重的肝损伤，进一步支持了GSDME在继发性坏死中的非必要性。

综上所述，本研究通过多个实验模型发现，GSDME的裂解虽然在DT或cisplatin诱导的细胞死亡过程中发生，但并非导致继发性坏死的必要条件。这与之前某些研究提出的观点相矛盾，也提示我们对继发性坏死的分子机制仍需深入探索。此外，研究团队还指出，虽然GSDME的裂解可能是一种由caspase激活引发的副反应，但它并不直接导致细胞膜破裂，而是可能与其他因素相互作用，从而影响继发性坏死的发生。

本研究的另一个重要发现是，caspase抑制剂可以部分防止DT诱导的细胞死亡，这为治疗某些疾病提供了潜在的策略。例如，在diphtheria的临床治疗中，caspase抑制剂可能具有一定的应用前景。然而，研究团队也强调，目前的实验结果仅基于HeLa和CD10细胞模型，尚需在更多细胞类型和动物模型中进一步验证这些发现，以全面评估caspase抑制在治疗中的潜在价值。

本研究还指出，尽管DT诱导的细胞死亡涉及凋亡途径，但其继发性坏死的发生并不依赖GSDME的裂解。这一发现挑战了之前关于GSDME在继发性坏死中的关键作用的假设，提示我们可能需要重新考虑某些细胞死亡机制的分子基础。此外，研究者还提到，继发性坏死过程中可能还存在其他未被充分研究的分子机制，这些机制可能在不同细胞类型或病理条件下发挥作用。

研究团队在实验设计上采用了多种方法，包括细胞成像、流式细胞术、Western blotting以及CRISPR/Cas9基因敲除技术。这些方法为理解继发性坏死提供了有力的工具，同时也揭示了GSDME在这一过程中的非必要性。研究结果表明，尽管GSDME在某些情况下被裂解，但其裂解并不直接导致细胞膜破裂，因此不能将其视为继发性坏死的核心机制。

此外，研究团队还指出，一些研究中所提到的GSDME在继发性坏死中的作用可能被高估。他们认为，GSDME的裂解可能只是caspase激活的副产品，而非关键的细胞死亡事件。因此，未来的研究应更加关注其他可能参与继发性坏死的分子，以及不同细胞类型在这一过程中的差异。

在实验方法方面，研究团队详细描述了使用的细胞系、培养条件、试剂以及实验步骤。例如，HeLa细胞和CD10细胞被用于体外实验，而C57Bl/6小鼠则用于体内实验。通过这些模型，研究者能够系统地评估GSDME在继发性坏死中的作用，并排除其他可能的细胞死亡机制，如铁死亡（ferroptosis）或坏死性凋亡（necroptosis）。这些实验设计不仅确保了研究的严谨性，也为后续研究提供了重要的参考。

研究团队还讨论了继发性坏死的临床意义。在某些疾病中，如diphtheria，继发性坏死可能与疾病进展密切相关。通过本研究，他们发现DT诱导的细胞死亡虽然涉及凋亡，但继发性坏死的形成并不依赖GSDME。这一发现可能对临床治疗策略产生重要影响，例如，通过抑制caspase来延缓或减轻某些疾病的病理变化。然而，研究团队也指出，这些发现仍需在更多细胞类型和动物模型中得到验证，以确保其普遍适用性。

在实验中，研究团队使用了多种caspase抑制剂，包括emricasan、qVD和zVAD。这些抑制剂在不同模型中表现出不同的效果，其中emricasan和qVD在某些情况下能够显著减少细胞死亡，而zVAD则效果有限。这表明，caspase抑制剂的作用可能因模型不同而有所差异，因此在实际应用中需要更加细致的评估。

本研究的局限性在于其仅基于特定的细胞系和动物模型，未能涵盖所有可能的细胞类型或病理条件。因此，未来的研究需要在更广泛的实验系统中验证这些发现，以全面理解继发性坏死的分子机制。此外，研究团队还提到，某些细胞类型可能对GSDME的裂解表现出不同的反应，这可能与细胞内特定的信号通路或环境因素有关。

总的来说，本研究通过多个实验模型揭示了GSDME在继发性坏死中的非必要性，挑战了之前的一些假设。这些发现不仅有助于我们更深入地理解细胞死亡的复杂机制，也为相关疾病的治疗提供了新的思路。尽管caspase抑制剂可能在某些情况下对继发性坏死具有一定的预防作用，但其在不同模型中的效果差异提示我们需要进一步探索其作用机制。未来的研究应结合更多实验系统，以全面评估GSDME在继发性坏死中的角色，并探索其他可能的分子机制。