综述：基于核酸的登革热病毒检测技术的进步：从RT-PCR到CRISPR生物传感技术

《Sensing and Bio-Sensing Research》：Advances in nucleic acid-based detection of dengue virus: From RT-PCR to CRISPR biosensing technologies

　　登革病毒（DENV）检测方法综述：传统PCR及等温扩增技术（如RT-LAMP、RT-RPA）在灵敏度和适用性上有所提升，但成本与操作复杂度仍限制其现场应用。纳米材料（金纳米颗粒、石墨烯氧化物）通过增强信号传导和探针结合，显著提高纳米 biosensing 的灵敏度和便携性。CRISPR/Cas系统（Cas12a、Cas13a）结合等温扩增（RT-RPA）实现 attomolar 级检测，并可通过多酶协同（如SHERLOCKv2）实现多血清型同步筛查。然而，技术标准化、试剂成本及环境稳定性仍是主要挑战。未来需整合纳米材料、CRISPR 和微流控技术，开发低成本、高稳定性的POCT方案。

　　近年来，登革热病毒（DENV）作为一种全球性的健康问题，特别是在热带和亚热带地区，其传播和感染率持续上升，给人类健康和社会经济发展带来了巨大挑战。为了有效应对这一疾病，研发快速、经济且灵敏的诊断方法显得尤为重要。这些方法不仅用于临床诊断，还用于疾病监测和基因型分析。目前，基于核酸（NA）的诊断技术，如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、实时RT-PCR（rRT-PCR）以及等温扩增技术如RT-LAMP（环介导等温扩增）和RT-RPA（重组酶介导的等温扩增）已被广泛应用。然而，这些技术在成本、处理时间以及设备需求等方面仍存在局限性，影响了其在点对点（POCT）和现场诊断中的应用。同时，纳米材料和CRISPR/Cas系统在提升诊断灵敏度、特异性和便携性方面展现出巨大潜力，为登革热的现场检测提供了新的解决方案。

### 登革热病毒及其诊断挑战

登革热病毒是一种由蚊子传播的黄病毒，主要通过雌性*Aedes aegypti*和*Aedes albopictus*蚊子传播，可引起从轻度登革热到严重形式如登革热出血热（DHF）和登革热休克综合征（DSS）等疾病。在过去二十年中，登革热病例数显著上升，从2000年的50万例增加到2019年的520万例，涉及129个国家。在新冠疫情期间（2020-2022），登革热病例有所减少，但2023年又出现了显著反弹，全球报告超过500万例病例，死亡人数超过5000人，创下了历史新高。这一趋势表明，登革热防控需要更加高效和便携的诊断技术。

登革热病毒分为四种主要血清型（DENV-1至DENV-4），并在2013年马来西亚发现了第五种遗传上不同的血清型（DENV-5）。这些血清型在热带和亚热带地区的广泛传播常常导致超流行病学传播，并增加二次感染的风险，而二次感染通常会导致更严重的疾病结果，这与抗体依赖性增强（ADE）有关。因此，了解这些血清型的遗传多样性和地理分布对于准确诊断、疫苗开发以及实施有效的公共卫生策略至关重要。

### 传统诊断方法的局限性

传统的诊断方法包括基于病毒抗原和抗体的检测，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和快速诊断试验（RDTs），以及基于核酸检测的方法，如RT-PCR和rRT-PCR。这些方法虽然在敏感性和特异性方面表现良好，但其操作复杂性、对专业人员和先进实验室设备的依赖性限制了其在资源匮乏地区的应用。此外，基于核酸的检测方法通常需要较长的处理时间，并且可能受到样本中干扰物质的影响。

### 等温扩增技术的进展

为了克服传统PCR技术的局限性，等温扩增技术如RT-LAMP和RT-RPA得到了发展。这些技术能够在恒定温度下进行扩增，无需热循环仪，从而提高了检测速度和便携性。例如，RT-LAMP能够在15分钟内完成检测，其检测灵敏度可达到0.8 fg/μL（约24.3 fM），显示出在资源匮乏地区早期诊断的潜力。RT-RPA则能够在30分钟内检测到10个RNA拷贝，具有较高的特异性。这些技术的结合不仅提高了检测效率，还增强了诊断的准确性，为现场快速诊断提供了可行的解决方案。

### 纳米材料在诊断中的应用

纳米材料因其独特的物理和化学性质，如磁性、光学和电学特性，被广泛应用于提高基于核酸的检测系统的灵敏度、特异性和便携性。金纳米颗粒（AuNPs）、氧化石墨烯（GO）、量子点和金属有机框架（MOFs）等纳米材料被用于增强探针杂交、信号传导和微型化。例如，使用磁性纳米颗粒进行病毒RNA提取可以提高检测效率，减少处理时间，并在资源匮乏地区实现快速检测。此外，纳米材料的集成使检测方法更加简便，降低了成本，并提高了诊断的准确性。

### CRISPR/Cas系统在诊断中的潜力

CRISPR/Cas系统最初是作为一种原核生物的适应性免疫防御机制被发现的，近年来在基因工程和分子诊断中展现出巨大潜力。该系统利用可编程核酸酶，通过合成的单链引导RNA（gRNA）来特异性切割目标核酸序列。CRISPR/Cas系统因其高特异性和灵敏度，特别是在检测RNA病毒方面，成为一种理想的诊断工具。例如，SHERLOCK和DETECTR等基于CRISPR的诊断平台利用旁观者切割活性进行荧光或比色读数，其灵敏度与RT-PCR相当。此外，CRISPR/Cas13a和Cas12a等不同类型的CRISPR系统被用于开发针对不同病毒的诊断方法，如登革热病毒、寨卡病毒（ZIKV）和埃博拉病毒等。

### 诊断技术的比较与挑战

尽管基于核酸的诊断技术在登革热检测中具有显著优势，但它们仍然面临诸多挑战。首先，登革热病毒的遗传多样性可能导致引物或探针结合区域的突变，从而影响检测的准确性。其次，传统PCR技术需要专业的人员和复杂的设备，限制了其在资源匮乏地区的应用。此外，等温扩增技术如RT-LAMP和RT-RPA虽然具有较高的灵敏度和特异性，但在引物设计、防止污染以及多靶标检测方面仍存在一定的技术障碍。为了实现可靠的现场诊断，需要进一步优化这些技术，以提高其在不同环境条件下的稳定性和再现性。

### 未来发展方向

随着技术的不断进步，未来登革热诊断技术的发展方向可能包括以下几个方面：首先，开发无扩增的CRISPR诊断平台，以减少检测步骤并提高灵敏度。其次，优化纳米材料的使用，使其在不同样本类型中保持高灵敏度和稳定性。此外，结合人工智能（AI）和机器学习（ML）技术，可以提高诊断的准确性，并支持数据驱动的疾病监测和控制。最后，推动多靶标检测和便携式诊断设备的开发，以实现快速、经济且高效的登革热检测。

总之，登革热病毒的诊断技术正在不断进步，从传统的PCR方法到新兴的等温扩增和CRISPR/Cas系统，这些技术的结合为实现快速、准确且便携的诊断提供了新的可能性。然而，为了实现这些技术在实际中的广泛应用，还需要进一步的技术优化、成本控制和标准化，以确保其在不同环境条件下的适用性和可靠性。通过跨学科的合作和持续的技术创新，有望在未来的登革热防控中发挥更大的作用。