无催化剂生物正交反应新突破：丙二腈与偶氮二甲酸酯加成反应及其在生物分子精准操控中的应用

《Nature Communications》：A catalyst-free bioorthogonal reaction for malononitrile addition to azodicarboxylates

　　本研究报道了一种无需催化剂的生物正交反应——丙二腈与偶氮二甲酸酯加成反应（MAAD），该反应在生理条件下具有快速、高选择性特点，成功应用于RNA/蛋白质标记、CRISPR-Cas9基因编辑精准调控等领域，为复杂生物系统的多维分析提供了新工具。

　　

在化学生物学领域，生物正交反应犹如一把"分子手术刀"，能够在不干扰生命活动的前提下对生物分子进行精准修饰和操控。从经典的Staudinger连接反应、铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC），到应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）和四嗪连接反应，这些技术虽然推动了生命科学研究的发展，但仍面临催化剂毒性、反应条件限制等挑战。

武汉大学的研究团队独辟蹊径，基于对丙二腈类化合物的深入研究，开发了一种全新的无催化剂生物正交反应平台。该团队发现丙二腈与偶氮二甲酸酯在室温和水相环境中即可发生快速加成反应，无需任何催化剂、碱或添加剂参与。反应通过协同过渡态进行，在90秒内即可完成，二级速率常数k₂=0.703 M^-1s^-1，展现出优异的反应动力学特性。

关键技术方法包括：在线傅里叶变换红外光谱（FTIR）实时监测反应动力学、电喷雾电离质谱（ESI-MS）验证生物分子标记效果、凝胶电泳分析蛋白质/RNA标记效率、CRISPR-Cas9/Cas13a基因编辑系统评估功能调控、GUIDE-seq技术全面分析基因编辑脱靶效应，以及细胞成像技术验证生物正交标记效果。

反应开发与优化

研究人员系统评估了MAAD反应在不同溶剂、pH条件和生物分子环境中的表现。结果表明，该反应在磷酸盐缓冲液（PBS）与有机溶剂混合体系（1:20）中20分钟内即可完成，且产物在生理条件下保持24小时稳定。特别值得注意的是，反应对谷胱甘肽（GSH）、L-半胱氨酸等生物硫醇以及牛血清白蛋白（BSA）等生物分子均表现出良好耐受性。

RNA标记应用研究

团队成功将丙二腈模块整合到RNA分子的2'-OH位点，实现了RNA的特异性标记。通过设计与生物素或BODIPY荧光基团连接的偶氮二甲酸酯衍生物，研究人员在体外和细胞水平验证了MAAD反应的高效性。激光共聚焦显微镜观察显示，转染了M11修饰RNA的HEK293T细胞经azo-BODIPY处理后出现明显的RNA荧光斑点，而天然RNA对照组无此现象，证实了该反应的生物正交特性。

蛋白质标记应用探索

在蛋白质标记方面，研究团队以牛血清白蛋白（BSA）和溶菌酶（LYZ）为模型，成功实现了蛋白质的丙二腈修饰和后续荧光标记。特别值得一提的是，利用西妥昔单抗（Cetuximab）抗体对A549细胞表面抗原的特异性识别能力，研究人员实现了活细胞水平蛋白质的特异性荧光标记，信号精确定位于细胞膜。

RNA功能时空调控

MAAD反应的独特优势在于能够通过空间位阻和极性变化精确调控RNA结构功能。研究发现，丙二腈修饰本身对RNA结构影响微小，但加入双偶氮二甲酸酯A9后，可显著改变RNA二级结构，抑制逆转录酶活性。在CRISPR-Cas9系统中，sgRNA的M11修饰浓度在35 mM以下时，Cas9酶活性保持良好，而经A9处理后，基因编辑效率出现浓度依赖性下降。

反应正交性验证

研究团队通过精心设计的三元CRISPR/Cas9切割实验，证实了MAAD反应与应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）、逆电子需求Diels-Alder反应（IEDDA）之间的良好正交性。三种不同修饰的sgRNA（叠氮化、降冰片烯化和丙二腈化）在混合体系中可被各自对应的生物正交反应特异性调控，互不干扰。

基因编辑脱靶效应控制

在细胞水平，研究人员将M11修饰的sg-SLX4IP转染至稳定表达Cas9的HeLa-OC细胞中，发现A9处理可显著降低基因编辑的脱靶效应。GUIDE-seq分析显示，MAAD处理使ON-target/2MM OFF-target比值从0.45提升至4.75（约10.6倍），ON-target比率从31.1%提高至78.7%。与传统Cas9小分子抑制剂Brd0539相比，A9对修饰sgRNA表现出更佳的选择性抑制效果。

这项研究开发的MAAD反应平台具有多重创新价值：其一，突破了传统生物正交反应对催化剂的依赖，避免了金属催化剂可能带来的生物毒性；其二，反应条件温和、速率快，适用于活细胞环境；其三，与现有主流生物正交反应体系兼容，为多靶点同时标记提供了可能。特别是在基因编辑领域，该技术为实现CRISPR-Cas9系统的时空调控、降低脱靶风险提供了新策略。

该研究成果于2025年11月5日在《Nature Communications》正式发表，武汉大学为第一完成单位。这项研究不仅拓展了生物正交化学的工具箱，更为精准医学、合成生物学等领域的发展提供了新的技术支撑。随着后续研究的深入，MAAD反应有望在药物递送、疾病诊断和治疗等多个方面发挥重要作用。