一种用于双歧杆菌的CRISPRi基因调控系统

《Microbial Biotechnology》：A CRISPRi Gene Regulation System for Bifidobacteria

　　CRISPR干扰系统在双歧杆菌中的开发与应用。本研究构建了基于枯草芽孢杆菌热移酶失活Cas9的CRISPRi系统，通过单质粒载体实现高效靶向基因 repression。该系统在双歧杆菌属多个物种（包括B. breve、B. longum、B. animalis）中成功抑制核苷酸代谢基因（upp）、多糖合成基因（Bbr_0430）及糖代谢基因（rafA、rbsA），证实其通用性和特异性。通过荧光素酶报告基因验证，系统可有效降低目标基因表达水平达90%以上，且无需优化转化条件。该工具突破了双歧杆菌遗传操作效率低、修饰系统复杂的瓶颈，为功能基因组学研究提供了新方法。

　　在人类肠道中，微生物群落构成了一个复杂而重要的生态系统，其中某些菌种如双歧杆菌（Bifidobacterium）作为核心成员，早在出生后不久就占据了肠道环境，并在整个生命过程中持续存在，尽管其数量会随着年龄增长而减少。双歧杆菌是一种革兰氏阳性、专性厌氧的细菌，已被广泛报道对宿主具有多种益处，包括促进免疫系统的发育与调节、保护机体免受病原菌侵袭、分解不可消化的碳水化合物以及缓解炎症性肠病症状等。然而，尽管双歧杆菌在人类健康中的重要性日益凸显，其在功能性食品和临床干预中的应用仍受到限制，主要原因在于对其功能机制的研究尚不充分。

随着基因工程技术的不断发展，CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）技术因其高效、精确和可编程的特性，逐渐成为研究微生物基因功能的重要工具。在本研究中，科学家们开发了一种基于CRISPR干扰（CRISPRi）的系统，用于在双歧杆菌中实现特定基因的表达抑制。CRISPRi利用了催化失活的Cas9蛋白（dCas9），通过单链引导RNA（sgRNA）靶向特定基因，阻止RNA聚合酶的正常运作，从而实现对目标基因的转录抑制。与传统的基因编辑方法相比，CRISPRi的优势在于它不需要破坏基因结构，而是通过调控表达水平来实现功能研究，这为探索双歧杆菌的分子机制提供了新的途径。

在研究过程中，科学家们首先验证了CRISPRi在双歧杆菌中的功能，使用了经过工程改造的双歧杆菌 breve UCC2003菌株，这些菌株被设计成表达来自热乳酸杆菌（Streptococcus thermophilus）的dCas9蛋白。结果显示，该系统能够有效抑制报告基因和内源性基因的表达，而无需对转化参数进行大量优化，也无需对序列进行特定的修饰以避免限制修饰系统的影响。这表明，该CRISPRi系统可以克服双歧杆菌在基因操作方面的传统障碍，从而为更广泛的基因功能研究提供了可能。

为了提高系统的实用性，研究人员还开发了一种单质粒CRISPRi系统，该系统能够在多种双歧杆菌物种中实现高效的目标基因表达抑制。通过使用这种系统，他们成功地针对不同物种的基因，如参与核苷酸代谢和碳水化合物代谢的基因，进行了基因表达的调控。这一成果不仅验证了CRISPRi在双歧杆菌中的有效性，还展示了其在非模型菌株中的应用潜力。这种方法不需要对转化效率进行特别优化，也避免了因限制修饰系统而需要预先了解特定菌株的序列特征，这大大简化了实验流程，提高了研究效率。

在实验设计方面，研究人员采用了多种方法来评估CRISPRi的效果。例如，他们使用了纳米荧光素酶（nanoluciferase）作为报告基因，通过荧光检测来评估基因表达的变化。同时，他们还进行了沉降实验，以观察目标基因被抑制后对菌株行为的影响。这些实验结果表明，CRISPRi能够有效地改变双歧杆菌的代谢特性，如抑制外源多糖的合成和特定碳水化合物的代谢能力。

此外，研究人员还对双歧杆菌的基因组进行了系统分析，利用开放源代码工具GuideFinder识别出适用于CRISPRi的引导RNA序列。他们发现，虽然双歧杆菌基因组中存在丰富的限制修饰系统，但通过适当的设计，仍然可以找到大量适合的靶点。这为构建针对不同基因的CRISPRi系统提供了理论基础，同时也为后续的功能基因组学研究打下了坚实的基础。

本研究不仅为双歧杆菌的基因工程提供了新的工具，还推动了对这些微生物在人体健康中所起作用的深入理解。通过CRISPRi技术，研究人员能够更精确地操控基因表达，从而探索其在不同环境条件下的功能表现。这种技术的应用有望促进双歧杆菌在益生菌产品开发和临床应用中的进一步研究，提高其在功能性食品和医疗干预中的科学依据和实际效果。同时，这项研究也为其他微生物的基因功能研究提供了参考，展示了CRISPRi在不同生物系统中的广泛应用前景。