哈萨克斯坦南部栽培果园与野生塞威氏苹果林中两种不同基因型解淀粉欧文氏菌的分子监测研究

《Journal of Plant Pathology》：Molecular monitoring reveals two distinct Erwinia amylovora genotypes threatening cultivated orchards and wild Malus sieversii reservoirs in southern Kazakhstan

　　本研究针对哈萨克斯坦南部栽培果园及野生塞威氏苹果（Malus sieversii）遗传资源保护区面临的梨火疫病威胁，通过系统性分子监测，首次揭示了该地区同时存在两种CRISPR基因型（A型和D型）解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）的流行格局。研究团队采用实时荧光定量PCR（qPCR）、免疫层析技术和CRISPR分型等方法，对131份样本进行病原鉴定和遗传分析，发现基因型分布存在地域特异性。该成果为跨境病原传播溯源和野生苹果种质资源保护提供了关键科学依据。

　　

在果实累累的苹果园中，一种名为梨火疫病（Fire blight）的毁灭性病害正悄然蔓延。这种由解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）引起的细菌性病害，能够感染蔷薇科的180多种植物，导致花朵、枝条枯萎变黑，形成典型的“牧羊杖”状弯曲，严重时整株果树死亡。对于哈萨克斯坦这样一个拥有丰富野生苹果资源，特别是栽培苹果重要祖先——塞威氏苹果（Malus sieversii）天然分布区的国家而言，梨火疫病的入侵不仅威胁着果园的经济收益，更可能对这些珍贵的野生基因库造成不可逆的破坏。

梨火疫病最早于2008年随着商业品种的引进传入哈萨克斯坦和吉尔吉斯斯坦。尽管采取了多种防控措施，但在适宜的气候条件下（温度约25°C、高湿度），疫情仍在扩散。更令人担忧的是，近年来疫情出现在更靠近野生苹果林的家庭果园中，敲响了警钟。野生苹果，特别是塞威氏苹果，蕴含着抗病、抗逆等宝贵基因，是未来品种改良的基石。一旦病原菌侵入这些野生种群，可能导致遗传资源永久丧失。因此，及时掌握病原菌的分布范围和遗传特征，成为制定有效防控策略、保护野生种质资源的关键。

为此，研究人员在2024年对哈萨克斯坦南部的阿拉木图州和突厥斯坦州进行了系统监测。这一年5-6月的气温（17.6-24.5°C）和湿度（44%-71%）条件非常有利于梨火疫病的发生。研究团队共收集了131份样本，不仅来自出现症状的栽培苹果、梨、榅桲、山楂和核桃，也特意包括了野生塞威氏苹果的无症状样本，其中9.2%的样本来自野生种群，包括野生与栽培苹果树共存的赛拉姆-乌甘国家自然公园。

在实验室中，研究人员遵循国际植物保护公约（IPPC）标准对样本进行处理。他们通过植物洗涤法获取病原菌，使用King's B培养基和利凡诺（levan）培养基进行细菌分离纯化。病原菌的鉴定采用了双重验证：免疫层析快速检测（Ea AgriStrip）和针对染色体amsC基因的实时荧光定量PCR（qPCR）。最终，通过分析细菌基因组中的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR），特别是CRISPR1区域中间隔序列1029（spacer 1029）是否存在重复，对病原菌进行基因分型，从而区分A型（有重复）和D型（无重复）这两种主要的原型谱系。

分子分析结果

通过对所有样本的植物洗涤液进行分子检测，共确认31份qPCR阳性样本，值得注意的是，所有阳性样本均来自栽培果树，未在野生塞威氏苹果树上检测到病原菌。成功从24份阳性样本中分离到纯细菌培养物，另有7份qPCR阳性样本因病原菌载量低或样品运输时间长等原因未能获得纯培养。基因分型成功应用于26份阳性样本（24株分离物及2份直接提取自植物洗涤液的核酸样本）。

CRISPR基因分型结果

基因分型结果显示，哈萨克斯坦南部同时存在两种解淀粉欧文氏菌的CRISPR原型基因型。在阿拉木图地区，主要流行的是之前已有报道的A型基因型（占本研究分析菌株的61.5%）。而在突厥斯坦地区，则首次发现以D型基因型为主要流行类型（占38.5%），并且在该地区只检测到D型。这表明两个相对邻近的区域存在着不同的病原菌种群结构。

这项研究在靠近赛拉姆-乌甘国家自然公园的区域检测到解淀粉欧文氏菌，对植物健康管理机构具有重要意义。它警示必须加强对引进苗木的检疫控制，并仔细监测靠近野生苹果自然生境的果园。栽培果园与野生种群毗邻而居，增加了病原菌向野生基因库溢出的风险，可能威胁到宝贵的遗传资源。本研究未发现野生苹果树感染火疫病，与此前的观察一致，但建议在相关保护区内引入定期监测，警惕疾病传入野生苹果林的可能性。

此外，本研究揭示了突厥斯坦地区同时存在A和D两种原型基因型，这种多样性可能源于多次引入事件，也可能是病原菌在当地适应过程中丢失了CRISPR重复序列所致。早期在阿拉木图地区的研究仅报道了A型基因型，这与中亚邻国以A型衍生的谱系为主的情况相符。突厥斯坦地区以D型为主，表明该地区存在一个更为多样化的解淀粉欧文氏菌种群。尽管D型基因株在2016年曾在阿拉木图地区被发现，但此后未见报道。

A型基因型常见于西欧和地中海地区，而D型则更常见于北欧和东欧国家。两种基因型在相对接近的区域共存，支持了可能存在多次引入事件的假设。同时，近期对中亚地区菌株的基因组分析也提出了另一种可能性，即解淀粉欧文氏菌正在适应本地区条件，导致其CRISPR重复区域内发生缺失，这种现象在吉尔吉斯斯坦等地已有观察。要确切阐明本研究中分离菌株的起源，需要进行全基因组测序分析。

总之，在哈萨克斯坦检测到两种不同的解淀粉欧文氏菌谱系，强调了持续进行分子监测的重要性。对栽培和野生寄主的同步监测对于理解梨火疫病的流行病学、减少进一步引入以及保护中亚独特的野生苹果多样性至关重要。