磷脂 scramblases TMEM16F与Xkr8介导肿瘤微环境中磷脂酰丝氨酸(PS)外化及免疫抑制的机制研究

《Cell Death Discovery》：Phospholipid scramblases TMEM16F and Xkr8 mediate distinct features of phosphatidylserine (PS) externalization and immune suppression to promote tumor growth

　　本研究针对肿瘤微环境中持续存在的磷脂酰丝氨酸(PS)外化现象，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术特异性敲除EO771乳腺癌细胞中的Xkr8和TMEM16F scramblases，系统探讨了凋亡细胞与存活细胞PS外化在肿瘤免疫逃逸中的独立作用。研究发现两种scramblase的缺失均能显著抑制免疫健全小鼠的肿瘤生长，且分别通过阻断巨噬细胞介导的胞葬作用（Xkr8-KO）和钙应激诱导的PS外化（TMEM16F-KO）发挥抗肿瘤效应。该研究为阐明PS介导的免疫抑制机制提供了直接证据，为开发新型免疫治疗策略奠定理论基础。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，肿瘤微环境（TME）中普遍存在的磷脂酰丝氨酸（PS）外化现象日益受到关注。PS作为典型的"吃我"信号，在正常生理状态下主要出现在凋亡细胞表面，通过与其受体（如TAM、TIM家族）结合促进免疫耐受。然而，在多种实体瘤中，PS却异常暴露于存活细胞表面，这种持续性的PS外化与免疫抑制、肿瘤进展密切相关。但迄今为止，肿瘤微环境中PS外化的具体细胞来源及其分子机制尚未明确，特别是凋亡细胞与存活细胞各自通过何种途径贡献于PS介导的免疫抑制，仍是该领域的关键科学问题。

为回答这一科学问题，研究人员选择EO771原位乳腺癌模型，聚焦于两种关键的磷脂scramblase——Xkr8（caspase激活型）和TMEM16F（钙激活型）。通过体内成像技术证实EO771肿瘤微环境中存在持续性PS外化后，研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建了Xkr8和TMEM16F敲除的EO771细胞系。令人惊讶的是，尽管两种scramblase的缺失均不影响肿瘤细胞的增殖、成球能力等内在特性，但在免疫健全小鼠模型中，Xkr8-KO和TMEM16F-KO肿瘤均表现出显著的生长抑制。进一步机制研究表明，Xkr8主要介导凋亡细胞的PS外化，其缺失导致巨噬细胞胞葬作用受损；而TMEM16F则负责钙应激诱导的存活细胞PS外化，内质网应激（如葡萄糖剥夺、MG132处理）可通过升高胞内钙离子激活TMEM16F，促进PS外化。纳米弦基因表达分析显示，两种scramblase敲除通过不同途径影响肿瘤微环境：Xkr8-KO下调IL-10和CTLA-4表达，同时上调HMGB1；而TMEM16F-KO则显著降低MFGE8和MMP9水平。该研究发表于《Cell Death Discovery》，首次在体内模型中直接验证了肿瘤细胞自身通过不同scramblase介导的PS外化在免疫逃逸中的关键作用。

关键技术方法包括：1）利用CRISPR/Cas9构建Xkr8和TMEM16F基因敲除的EO771及MC38肿瘤细胞系；2）通过体内成像（IVIS/PET-CT）追踪PS靶向抗体（Bavituximab/11.31）在肿瘤模型的分布；3）采用Incucyte实时监测系统分析细胞增殖、成球及PS外化动力学；4）建立原代骨髓源性巨噬细胞（BMDM）与pHrodo标记凋亡肿瘤细胞的共培养体系评估胞葬效率；5）应用纳米弦Pan-Cancer IO 360 Panel进行肿瘤微环境基因表达谱分析。

研究结果：

PS在EO771原位移植瘤模型肿瘤微环境中持续性外化

通过表达纯化多种PS靶向抗体（11.31、1N11、Bavituximab）及Gla-EGF融合蛋白，体内成像证实这些探针能特异性富集于EO771肿瘤组织，且这种富集可持续至注射后72小时，证明肿瘤微环境中存在可供靶向的持续性PS外化。

Ablation of Xkr8 on EO771 tumor cells blocks PS externalization on dying cells without altering cell-intrinsic oncogenic properties

qRT-PCR显示Xkr8是EO771细胞中表达最显著的Xkr家族成员。成功构建Xkr8-KO细胞系后，发现其Staurosporine诱导的凋亡性PS外化（Annexin V结合）显著受损，但细胞增殖、成球能力及Gas6/Akt信号通路未受影响。

Xkr8 knockout on tumor cells reduces tumor growth in vivo in the orthotopic EO771 breast cancer model

在免疫健全C57BL/6小鼠中，Xkr8-KO肿瘤体积和重量显著低于野生型，且脾脏重量减小。然而在NSG或Rag1-KO免疫缺陷小鼠中，Xkr8-KO与WT肿瘤生长无差异，表明其抗肿瘤效应依赖适应性免疫系统。

Ablation of TMEM16F on EO771 tumor cells blocks PS externalization on calcium-stressed cells without altering cell-intrinsic oncogenic properties in EO771 cells

TMEM16F是EO771细胞中表达最显著的TMEM16家族成员。TMEM16F-KO细胞在钙离子载体A23187刺激下PS外化能力显著降低，而Xkr8-KO细胞仍保留钙诱导的PS外化能力。TMEM16F缺失同样不影响肿瘤细胞的内在恶性表征。

TMEM16F KO on tumor cells reduces tumor growth in the EO771 orthotopic model of breast cancer

在免疫健全小鼠中，TMEM16F-KO显著抑制EO771乳腺癌和MC38结肠癌的生长，并延长小鼠生存期。与Xkr8-KO不同，TMEM16F-KO在Rag1-KO小鼠中仍显示部分抗肿瘤效果，提示其作用机制可能涉及除适应性免疫外的其他因素（如血管生成或基质重塑）。

Distinct phenotypic outcomes in the Xkr8 and TMEM16F knockout EO771 cells

胞葬实验显示，Xkr8-KO凋亡细胞被巨噬细胞吞噬的效率显著降低，而TMEM16F-KO细胞则不受影响。流式细胞术进一步证实Xkr8特异性介导凋亡相关的PS外化。

Intracellular calcium regulation and PS externalization in tumor cells

通过GCaMP6f钙指示剂系统证实，虽然TMEM16F-KO与WT细胞在钙离子载体刺激下胞内钙水平升高程度相当，但仅WT细胞表现出显著的PS外化。葡萄糖剥夺和低剂量MG132处理均可通过诱导内质网应激和钙信号激活TMEM16F介导的PS外化，且这种效应可持续24小时。

Effects of scramblase KO on the tumor microenvironment

基因表达谱分析揭示两种scramblase敲除通过独特途径影响肿瘤微环境：Xkr8-KO下调IL-10和CTLA-4，上调HMGB1，提示胞葬作用减少可能导致免疫原性增强；TMEM16F-KO则显著降低MFGE8和MMP9表达，同时增加Caspase-1和CSF-1水平。EGFR是两种KO共同下调的基因。

本研究通过精准的基因编辑策略，在体内外水平系统阐明了Xkr8和TMEM16F两种scramblase在肿瘤PS外化及免疫抑制中的独立作用。研究不仅证实了肿瘤细胞自身是肿瘤微环境中PS的重要来源，更首次揭示凋亡相关（Xkr8介导）与应激相关（TMEM16F介导）的PS外化通过不同机制协同促进肿瘤免疫逃逸。这一发现为理解PS在肿瘤微环境中的复杂生物学功能提供了新视角，提示针对特定scramblase的联合干预策略可能成为增强抗肿瘤免疫的新途径。该研究为开发以PS-scramblase轴为靶点的精准免疫治疗奠定了坚实的理论基础。