外着丝粒KMN复合体的组成与结构在真核生物界间具有保守性

《Communications Biology》：The composition and structure of the outer kinetochore KMN complex is conserved across kingdoms

　　本研究旨在阐明植物中负责染色体精确分离的关键复合体——外着丝粒KMN复合体的组成。研究人员通过亲和纯化质谱分析、体内定位和功能丧失突变体分析，在模式植物拟南芥中鉴定出13个KMN蛋白，其中包括6个此前未表征的亚基（DSN1、CSM1、NSL1.1/.2、ZWINT1.1/.2）。研究证实了这些新亚基的动粒定位和必需性，并通过AlphaFold3结构预测揭示了其与酵母/哺乳动物KMN复合体相似的三维组织。结论指出KMN复合体在远缘真核生物间具有匹配的组成和相似的组织结构，表明其存在于所有现存真核生物的共同祖先中。

　　

在生命的世界里，每一个细胞的分裂都是一场精心编排的舞蹈，而染色体的精确分离则是这场舞蹈成功的关键。确保染色体正确分离的核心“指挥中心”是动粒（Kinetochore），这是一个附着在染色体着丝粒区域的大型多亚基蛋白质复合体。其中，外动粒负责与细胞分裂过程中的“绳索”——纺锤体微管（Microtubules）——进行连接，这个关键部分被称为KMN复合体。该复合体因其三个核心亚复合体KNL1C、MIS12C和NDC80C而得名。在人类和芽殖酵母中，KMN复合体由10个蛋白质亚基组成，并且这些组分在两者之间显示出高度的保守性。然而，一个悬而未决的根本问题是：在亲缘关系更远的真核生物（例如植物）中，KMN复合体的组成和结构是否同样保守？这个问题对于理解动粒机制的起源和演化至关重要。

为了回答这个问题，由Dipesh Kumar Singh和Raphael Mercier共同领导的研究团队将目光投向了模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）。他们的研究成果发表在《Communications Biology》上，题为“The composition and structure of the outer kinetochore KMN complex is conserved across kingdoms”。这项研究通过综合运用生物化学、细胞生物学、遗传学和前沿的计算结构生物学方法，首次在植物中系统地定义了完整的KMN复合体，揭示了其惊人的保守性，同时也发现了一些独特的演化适应特征。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：利用亲和纯化结合质谱分析（AP-MS）技术从拟南芥细胞培养物中系统性鉴定与已知动粒蛋白（DSN1, CSM1, KNL1）相互作用的蛋白质复合体；通过免疫荧光定位技术，在植物体内（in planta）验证新鉴定蛋白在细胞间期和有丝分裂/减数分裂期的动粒定位；利用CRISPR-Cas9基因编辑和T-DNA插入突变体技术，创制关键基因的缺失突变体，并通过表型观察和遗传学分析评估其功能必需性；最后，借助AlphaFold3人工智能蛋白质结构预测程序，构建并比较了拟南芥、人类和芽殖酵母KMN复合体的三维模型，从结构层面分析其保守性与差异性。

Affinity purification coupled to mass spectrometry Identify KMN proteins

研究人员首先以拟南芥中基于序列相似性推测的KMN亚基同源物DSN1、CSM1以及近期已表征的KNL1作为“诱饵”（Bait），在拟南芥细胞培养物中进行了五次独立的亲和纯化质谱（AP-MS）实验。通过严格的定量比较和假阳性过滤，他们鉴定出42个特异性相互作用蛋白。令人瞩目的是，有16个蛋白质在所有五次AP-MS实验中均被系统地鉴定到。这其中包括三个诱饵蛋白自身、6个此前已知的拟南芥KMN亚基（NDC80, NUF2, SPC24, SCP25, MIS12, NNF1），以及两个已知的动粒相关蛋白CENPC和BMF1。这一结果强有力地证实了AtDSN1、AtCSM1和AtKNL1确实属于KMN复合体。此外，研究还鉴定出四个非常稳健的候选蛋白，它们对应两对旁系同源物：AT3G23910/AT3G24255（95%同一性）和AT4G00525/AT1G01715（43%同一性）。通过远程同源性搜索（HHpred），前一对被鉴定为ZWINT1的同源物，后一对被鉴定为NSL1的同源物。因此，研究人员将它们分别命名为ZWINT1.1/ZWINT1.2和NSL1.1/NSL1.2。肽段计数显示，ZWINT1.1和NSL1.1在动粒上的丰度分别高于其旁系同源物ZWINT1.2和NSL1.2。研究还稳健地检测到了SUMO蛋白酶ESD4，提示其在动粒动力学中可能扮演未知角色。

DSN1, CSM1, KNL1 ZWINT1.1 and NSL1.1 co-localize with CENH3

为了验证这些新鉴定蛋白的动粒定位，研究人员通过免疫定位实验检测了它们在植物体细胞中的位置。结果显示，Venus荧光蛋白标记的DSN1、KNL1、NSL1.1和ZWINT1.1，以及通过特异性抗体检测的内源CSM1，在细胞间期均呈现出10个清晰的焦点信号，这与拟南芥体细胞中着丝粒的预期数量完全吻合。更重要的是，这些焦点信号与着丝粒特异性组蛋白变体CENH3的信号完全共定位，并且都位于DAPI强染色的异染色质区域。这一发现直接证实了CSM1、DSN1、KNL1、NSL1.1和ZWINT1.1是拟南芥动粒的组成成分。此外，在有丝分裂中期染色体上，CSM1定位于朝向纺锤极的外动粒区域，而CENH3则位于内动粒区域，这进一步支持了CSM1作为外动粒KMN复合体成员的身份。

Most KMN genes are essential

功能丧失突变体分析揭示了这些KMN亚基的生物学重要性。对于单拷贝基因CSM1、DSN1和KNL1，杂合突变体的角果中约有25%的种子是萎缩的，且在其后代中完全无法获得纯合突变体，符合孟德尔分离定律，表明这些基因的纯合缺失导致胚胎致死。这与之前报道的MIS12、NNF1、NDC80、NUF2、SPC24、SPC25等KMN亚基突变体的表型一致，凸显了每个KMN复合体亚基对细胞正常分裂的极端重要性。对于ZWINT1旁系同源物，研究发现ZWINT1.1和ZWINT1.2均为必需基因，但其纯合突变体胚胎能够发育至种子成熟并萌发，之后幼苗死亡，其致死表型较其他KMN亚基突变体温和，表明两个旁系同源物之间存在部分功能冗余。对于NSL1旁系同源物，所获得的nsll.1和nsll.2单突变及双突变体均能存活且育性正常，仅双突变体表现出生长稍慢和轻微的种子败育（8.8%）。但由于所使用的突变体并非完全缺失，可能仍保留了部分功能，因此NSL1在拟南芥中是否必需尚需通过完全缺失突变体来最终确认。

Predicted structural divergence and conservation of the KMN complex across species

利用AlphaFold3进行的结构预测为KMN复合体的保守性提供了三维视角。预测的整体模型显示，拟南芥外动粒的核心架构与人类和酵母的实验结构或预测模型总体相似。然而，在亚基水平上存在显著的结构差异。例如，ZWINT1蛋白表现出最高的发散度：拟南芥中有两个RWD结构域，芽殖酵母中有一个，而人类中则没有。在MIS12模块中，拟南芥缺少了在人类和酵母中存在的Dsn1-Nsl1四螺旋束，而这个结构域在人类和酵母中与自我抑制及CENPC结合竞争有关。一个关键的发现是，在拟南芥和芽殖酵母中，CSM1同源二聚体被预测并通过实验证实与KMN复合体结合，而人类中尚未发现CSM1的同源物，这表明CSM1可能存在于真核生物共同祖先，但在动物谱系中丢失了。此外，CENPC通过其N端无序区域与MIS12模块结合的机制在三个物种中均被预测是保守的。

Predicted interactions between atESD4, atBUB3.3, AtBMF1/MAD3 and CENPE with the KMN complex

研究人员还利用AlphaFold3预测了AP-MS中鉴定到的其他动粒相关蛋白（ESD4, BUB3.3, BMF1, CENPE）与KMN核心复合体的相互作用模式。预测表明，AtESD4可能通过一个螺旋区域与AtCSM1的卷曲螺旋相互作用；AtBUB3.3则可能通过与AtKNL1 N端区域的“MELT-like”基序（在拟南芥中为“Met-Ser-Ile-Val”）结合，这与酵母中的模式相似。出乎意料的是，预测显示AtBMF1/MAD3的TPR结构域可能与AtCENPC的N端无序区域直接相互作用，这与人类和酵母中BMF1同源物（BubR1/Mad3）主要与KNL1相互作用的模式不同。对于AtCENPE，预测其与AtBUB3.3存在直接相互作用，而非像人类中那样与MAD3或KNL1相互作用。这些预测揭示了植物动粒在招募纺锤体组装检验点（SAC）相关蛋白方面可能存在独特的机制。

综上所述，这项研究通过多学科方法，在拟南芥中鉴定并功能验证了包含13个亚基的完整KMN复合体，首次在植物中确立了DSN1、CSM1、ZWINT1和NSL1作为保守的KMN组分。研究结论强调，尽管存在一些局部变异（如结构域的获得或丢失、相互作用的重新布线），但KMN复合体的基本组成和整体结构在植物、真菌和动物这些远缘真核生物之间是惊人地保守的。由于植物和真菌/动物谱系在真核生物演化早期就已分开，这种高度的保守性强烈表明，具有匹配组成的KMN复合体存在于所有现存真核生物的共同祖先中。这项工作不仅填补了植物动粒生物学的重要空白，为理解动粒的演化和功能提供了关键见解，也为后续研究植物特有的染色体分离调控机制奠定了坚实基础。研究所鉴定的新动粒组分和预测的相互作用网络，为未来探索植物细胞分裂、基因组稳定性以及作物改良提供了新的分子靶点和研究方向。