Oct4增强子在多能干细胞状态转换和胚胎发育中的特异性功能解析

《Stem Cell Reports》：Dissecting Oct4 enhancer function in pluripotent stem cells and mouse embryogenesis

　　本研究针对OCT4基因远端增强子(DE)和近端增强子(PE)在多能性维持和胚胎发育中的功能不清问题，通过CRISPR-Cas9技术构建增强子缺失的干细胞系和小鼠模型，发现DE对初始态多能性至关重要而PE对始发态多能性不可或缺。该研究揭示了增强子功能的上下文依赖性，为理解多能性调控网络提供了重要工具和理论依据。

　　

在生命科学领域，OCT4（octamer-binding transcription factor 4）一直被尊为多能性的"主调控因子"，其表达精确局限于多能细胞和生殖细胞。然而，这个关键基因的表达是如何被精确调控的？科学家们早就发现，OCT4的表达受到两个顺式调控元件——远端增强子(DE)和近端增强子(PE)的严格控制。尽管这些增强子已被广泛用作多能干细胞的标志物，但它们在生物学上的确切功能却一直笼罩在神秘之中。

多能干细胞具有独特的自我更新能力，能够在体外维持不同的多能状态，并分化为所有成体细胞类型。小鼠多能干细胞可以在体外稳定代表胚胎外胚层发育的不同阶段：来自囊胚内细胞团(ICM)的细胞产生初始态小鼠胚胎干细胞(mESCs)，而从着床后外胚层分离的细胞则形成始发态小鼠外胚层干细胞(mEpiSCs)。尽管两者都具有多能性，但它们在集落形态、分子特征和发育潜能上存在显著差异。

在这项发表于《Stem Cell Reports》的研究中，Daniel A. Schmitz、Daiji Okamura等研究人员采用功能缺失策略，系统解析了Oct4的PE和DE在多能状态维持、状态转换、分化和胚胎发育中的作用。通过CRISPR-Cas9基因组编辑技术，他们成功构建了增强子缺失的干细胞系和动物模型。

研究团队采用的关键技术方法包括：利用双荧光策略富集同时表达两个sgRNA的细胞，通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑实现增强子的大片段缺失；建立增强子缺失的小鼠胚胎干细胞(mESCs)、小鼠外胚层干细胞(mEpiSCs)和人类胚胎干细胞(hESCs)模型；运用免疫荧光染色、定量逆转录PCR、胚胎体分化实验、畸胎瘤形成实验和囊胚嵌合体生成等技术进行功能验证；通过小鼠模型研究增强子缺失对胚胎发育的影响。

Oct4 PE对初始态多能性和分化是非必需的

研究人员首先成功构建了△PE mESC细胞系。令人惊讶的是，在初始态培养条件(2iL培养基，含CHIR99021、PD0325901和LIF)下，△PE mESCs在自我更新或核心多能性标志物表达方面与对照组相比没有显示缺陷。这些细胞保持了正常的集落形态和增殖能力。

更令人惊奇的是，△PE mESCs在体外分化实验中仍能形成表达三个胚层特异性标志物的细胞：TUBB3（外胚层）、FOXA2（内胚层）和cTnT（中胚层）。在体内畸胎瘤实验中，△PE mESCs也能产生包含三个胚层衍生物的畸胎瘤，尽管体积较野生型小。这种体积缩小可能与分化过程中细胞凋亡增加有关，因为△PE胚胎体中出现更多caspase-3阳性细胞。

在发育潜能评估中，△PE mESCs能够贡献到E6.5嵌合体胚胎的外胚层，但到E7.5时，大多数EGFP阳性的△PE细胞消失，仅存稀疏的供体细胞。在出生的嵌合体小鼠中，供体细胞贡献的频率和水平显著降低，表明PE的缺失损害了供体细胞在着床后的存活。

Oct4 PE对维持始发态多能性至关重要

当研究人员尝试将△PE mESCs从初始态转换为始发态时，发现这些细胞无法稳定获得始发态特性。在AFX培养基（含Activin A、FGF-2和XAV939）中培养5天后，只有野生型细胞形成典型的始发态集落，而△PE细胞则未能形成。少数△PE细胞集落显示出与mEpiSCs不一致的形态，表达滋养层细胞标志物如Eomes、CDX2和GATA3，表明发生了向滋养层样细胞的转分化。

Oct4 DE对始发态多能性和体外分化是非必需的

与PE的作用相反，研究发现DE对维持始发态多能性是非必需的。△DE mEpiSCs和△DE hESCs在始发态条件下均保持了OCT4、NANOG和SOX2的强表达，并具有典型的集落形态。在分化潜能方面，△DE hESCs形成的胚胎体也能产生三个胚层的细胞，表明DE对多谱系分化不是必需的。

然而，当研究人员尝试将△DE hESCs转换为初始态时，这些细胞在5iLA培养基中培养5天后失去了OCT4和SOX2表达以及未分化集落形态，表明OCT4 DE对于获得人类初始态多能性是必需的。

Oct4增强子缺失小鼠模型的胚胎表型

为了研究增强子在胚胎发育中的作用，研究人员构建了携带△PE和△DE等位基因的小鼠模型。尽管△PE mESCs在体外表现正常，但△PE纯合子胚胎在E7.5时出现发育缺陷，包括前后轴形成异常，OCT4表达从E6.5开始下降，到E7.5时几乎检测不到。

令人意外的是，△DE纯合子胚胎在E3.5时能正常形成囊胚并保持ICM中的OCT4和SOX2表达，表明在着床前发育阶段，尽管DE完全缺失，Oct4表达仍得以维持。表型异常直到E7.5才变得明显，此时△DE胚胎出现发育延迟和轻度形态缺陷。

增强子缺失导致胚胎致死

基因型分析显示，在△PE+/-或△DE+/-互交的后代中，没有回收到△PE-/-或△DE-/-个体，表明任一增强子的完全缺失都会导致胚胎致死。然而，复合杂合子（△PE+/-,△DE+/-）能够正常发育并具有生育能力，说明每个Oct4增强子的一个功能性拷贝就足以支持胚胎和生殖系发育。

本研究通过增强子删除策略揭示了Oct4的DE和PE在多能性和胚胎发育中具有独特且上下文依赖性的功能。研究发现，PE对维持初始态多能性是非必需的，而DE对维持始发态多能性是非必需的，两种增强子缺失的干细胞都保留了多谱系分化能力。然而，它们在状态转换中表现出特异性需求：△PE mESCs无法稳定获得始发态，而△DE hESCs不能转换为初始态。

在胚胎发育层面，任一增强子的双等位缺失都会导致OCT4表达缺失和胚胎致死，而每个增强子的一个功能性拷贝足以支持正常发育。这些发现不仅深化了我们对多能性调控网络的理解，而且提供的干细胞系和小鼠模型为未来研究增强子在生殖系特化和谱系承诺中的功能提供了宝贵平台。

该研究的创新之处在于揭示了培养干细胞与胚胎外胚层在增强子需求上的差异，强调了体内外模型结合研究基因调控的重要性。这些发现对干细胞生物学、发育生物学和再生医学领域都具有重要意义，为精确调控多能性状态提供了新的理论依据和实验工具。