线粒体钙摄取蛋白1（micu1）的敲除通过调节鱼类的线粒体稳态，改善了由寒冷引起的细胞死亡和炎症反应

《Journal of Thermal Biology》：Mitochondrial calcium uptake 1 ( micu1) knockout ameliorates cold-induced cell death and inflammatory response by mediating mitochondrial homeostasis in fish

　　micu1在暗纹东方鲀冷耐受中的作用及机制研究

　　在当前全球气候变化和极端天气频发的背景下，水温的异常波动对水产养殖业构成了重大挑战。特别是对于那些对温度变化较为敏感的鱼类，如尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus），低温胁迫可能导致食欲下降、生长受阻、免疫力降低，甚至大规模死亡。因此，探索鱼类的抗寒基因并培育出具有抗寒能力的新品种，成为提升水产养殖可持续性和经济效益的重要研究方向。

研究团队聚焦于一种重要的线粒体相关蛋白——Mitochondrial Calcium Uptake 1（micu1），该蛋白在调节线粒体钙离子（mCa2?）水平、维持线粒体稳态、氧化还原平衡以及炎症反应中发挥关键作用。此前，micu1在哺乳动物中的功能已被广泛研究，表明其在细胞信号传导、表观遗传调控、代谢过程及细胞死亡中的重要性。然而，关于micu1在鱼类，尤其是对低温高度敏感的尼罗罗非鱼中功能的研究仍处于空白状态。为此，研究者采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对尼罗罗非鱼进行了micu1基因的敲除实验，以评估其在体内环境下的功能表现。

实验结果表明，在低温胁迫下，micu1基因敲除的尼罗罗非鱼表现出显著的抗凋亡信号减少，同时促凋亡基因和炎症相关基因的表达水平明显下降。这说明micu1在维持细胞稳态和抗寒能力方面具有重要作用。此外，micu1基因的敲除还促进了细胞存活，提升了谷胱甘肽（GSH）活性，降低了活性氧（ROS）的积累，从而在一定程度上增强了鱼类的抗寒性能。这些发现不仅有助于理解micu1在鱼类应对低温胁迫中的具体作用机制，也为水产养殖业中抗寒品种的分子育种提供了理论依据和基因靶点。

为了进一步验证micu1的功能，研究团队还对另一种经济价值较高的鱼类——暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）进行了相关研究。暗纹东方鲀是一种对温度变化较为敏感的鱼类，其最适生长温度为23至32摄氏度。当冬季出现寒潮，水温下降至17摄氏度以下时，其摄食活动和生长速率会显著降低。长期暴露在这样的低温环境下，会导致暗纹东方鲀的生存状况恶化，甚至引发大规模死亡，造成严重的经济损失。为此，江苏的中扬集团通过五代选择性育种技术，成功培育出一种具有抗寒能力的暗纹东方鲀品系。与野生型（WT）暗纹东方鲀相比，该品系在12摄氏度时不会出现失衡和皮肤充血等冻伤症状，甚至在7摄氏度时仍能维持正常的生理状态，其极限耐寒温度接近4摄氏度。

研究团队从暗纹东方鲀中成功克隆并表征了micu1基因。该基因编码一个由489个氨基酸组成的蛋白质，具有典型的EF-hand结构，并且与其他鱼类的micu1基因具有较高的序列同源性。通过组织分布分析和低温胁迫下的表达模式研究，发现micu1在健康组织中广泛表达，尤其在脑部表达最为显著。在低温胁迫下，micu1在野生型和抗寒型暗纹东方鲀的多种组织中表现出显著激活，但其表达模式存在差异。进一步的实验表明，当在暗纹东方鲀鳃细胞中敲除micu1基因时，线粒体膜电位（MMP）得以维持，细胞存活率提高，同时ROS的产生减少。此外，micu1基因敲除还影响了与铁死亡（ferroptosis）、凋亡（apoptosis）和炎症反应相关的基因表达，如trf1a、gpx4、aft3、slc7a11、aifm2、acsl4和hepcidin，以及bad、bax、p53、fadd和caspase3等基因。这些结果表明，micu1在维持细胞稳态、抑制低温诱导的ROS生成、铁死亡和凋亡方面具有重要作用。

研究团队还对尼罗罗非鱼进行了行为分析，发现micu1基因敲除的个体在低温环境下表现出更高的活动性。这一发现进一步验证了micu1在抗寒能力中的关键作用。结合体内和体外实验结果，可以得出结论：micu1在鱼类的抗寒能力中起着至关重要的作用，它通过维持细胞膜电位、抑制低温诱导的ROS生成、铁死亡和凋亡，从而增强鱼类的抗寒性。该研究不仅有助于揭示micu1在鱼类应对低温胁迫中的具体作用机制，也为水产养殖业中抗寒品种的分子育种提供了重要的理论支持和基因靶点。

在实验方法方面，研究团队严格遵循伦理规范，所有实验操作均经过上海海洋大学科学伦理委员会的批准。实验过程中，鱼类在采样前均使用MS-222麻醉剂进行麻醉，以减少其应激反应。健康的暗纹东方鲀由中扬公司提供，并在24摄氏度环境下适应两周后进行组织采样。研究团队采集了脑、肝、鳃、心、肾和肠道等组织样本，并在低温胁迫实验中进一步分析了其生理和分子变化。

此外，研究团队对micu1基因的结构和功能进行了深入分析。通过预测其编码蛋白的分子量和等电点，以及构建其三级结构模型，发现micu1具有由α螺旋和无规卷曲组成的结构。系统发育分析显示，micu1蛋白在硬骨鱼和哺乳动物中形成了不同的分支，且所有同源蛋白均包含两个保守的EF-hand钙离子结合结构域。这些结构域对于micu1在调节线粒体钙离子水平、维持线粒体稳态和细胞信号传导中的作用至关重要。

研究还发现，micu1在鱼类中的功能可能与哺乳动物中的功能存在一定的相似性，但又具有独特的适应性。例如，在哺乳动物中，micu1被证明在调节线粒体钙离子信号传导、细胞凋亡和炎症反应中发挥重要作用。而在鱼类中，micu1的表达模式和功能表现可能受到环境因素的影响，如水温变化和营养状况。因此，研究团队通过不同实验方法，包括基因敲除、组织表达分析和行为观察，全面评估了micu1在鱼类抗寒能力中的作用。

综上所述，该研究不仅揭示了micu1在鱼类抗寒能力中的关键作用，还为水产养殖业中抗寒品种的分子育种提供了重要的理论支持和基因靶点。通过深入理解micu1在鱼类应对低温胁迫中的具体作用机制，研究者可以更好地设计和实施抗寒育种策略，从而提升水产养殖的可持续性和经济效益。这一研究成果有望为未来水产养殖业的发展提供新的思路和方向，同时也为相关领域的科学研究提供了重要的参考价值。