综述：用于原核生物和真核生物的高通量、多重化和自动化基因组编辑的分子方法

《Current Opinion in Biotechnology》：Molecular methods for high-throughput, multiplexed, and automated genome editing in prokaryotes and eukaryotes

　　基因组编辑技术综述：探讨Recombineering、CRISPR/Cas9系统、Base编辑及转座酶在原核和真核生物中的应用，强调自动化实验室平台（如生物工厂）通过整合分子工具、微流体技术和AI驱动流程实现大规模并行编辑，推动合成生物学发展。

　　近年来，随着基因组工程技术的快速发展，科学家们在构建基因改造生物体方面取得了显著进展。这些技术的突破使得实验室操作流程能够以更高的效率和更大的规模进行，同时推动了合成生物学领域的进步。随着DNA编辑技术的不断成熟，研究人员开始实现对生物体的多基因位点同时改造，从而显著提升了基因工程的能力。与此同时，实验室自动化技术的普及使得这些复杂的基因组编辑任务逐渐从传统的人工操作转移到机器人辅助的平台中，这不仅提高了实验的可重复性，还实现了更高效的高通量生物体构建。这些自动化平台在现代分子生物学工具的应用中扮演着至关重要的角色，它们使大规模并行的基因组编辑成为可能，同时也为生物技术领域提供了更多创新机会。

为了支持高通量、并行化的基因组编辑，科学家们开发了多种DNA合成和构建方法。其中，黄金门组装（Golden Gate Assembly, GGA）作为一种高效的DNA片段组装技术，利用类型IIS限制性内切酶和T4 DNA连接酶，实现了多个DNA片段的同时、定向组装。这一技术及其衍生的模块化克隆框架，如模块化克隆（Modular Cloning, MoClo），在基因组工程领域发挥了重要作用。MoClo方法通过标准化的克隆语法，使得DNA构建过程更加系统化和高效，适用于多种生物体，包括细菌、酵母、真菌、植物和哺乳动物细胞。近年来，基于GGA的方法进一步优化，能够通过合成寡核苷酸池构建数百个经过优化的基因，从而大幅降低基因合成的成本。

除了GGA，还有其他多种DNA构建方法被开发出来，以适应不同生物体的需求。例如，PlasmidMaker结合了用户友好的设计界面和完全集成的机器人系统，使用来自Pyrococcus furiosus的Argonaute蛋白（PfAgo）为基础的合成限制性酶，实现了高效的DNA构建。该方法已经被用于构建超过100种不同大小和复杂度的质粒，证明了其在高通量基因组工程中的潜力。此外，利用噬菌体酶辅助的体内DNA组装技术也在不断进步，能够在多种生物体中进行基因组编辑，包括大肠杆菌、Ralstonia eutropha、Pseudomonas putida、Lactobacillus plantarum以及酵母Yarrowia lipolytica。这种技术的优势在于其不需要传统的克隆宿主，减少了构建时间和成本，特别是在结合其他工具如CRISPR相关系统时，可以实现更高效的基因组编辑。

在基因组编辑技术方面，CRISPR/Cas系统因其高度的可编程性和目标特异性，已成为基因工程中最常用的工具之一。然而，由于其依赖于双链断裂（DSB）机制，进行多基因位点的编辑可能会对目标细胞造成较大的压力。尽管如此，已有研究在细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中成功实现了多基因编辑。为了提高编辑效率，一些研究团队尝试将CRISPR/Cas系统与体内DNA组装技术结合，例如在Trichoderma reesei中利用CRISPR/Cas9进行37 kb基因簇的整合，通过体内组装技术提高了基因构建的效率。同时，一些方法如CREATE（CRISPR-Enabled Trackable Genome Engineering）被用于生成大规模的突变库，并通过条形码追踪技术筛选有益的突变，这在细菌的基因组工程中显示出巨大潜力。

CRISPR相关转座酶（CRISPR-associated transposases, CASTs）作为一种新兴的基因组编辑技术，利用了nuclease-deficient CRISPR/Cas系统与转座子的结合，实现了无需DSB或同源臂的靶向基因整合。这一方法不仅减少了细胞应激，还简化了基因工具的设计。CASTs已经被成功应用于多种生物体，包括细菌、植物细胞和人类细胞系，能够实现大基因片段的插入，并支持多基因位点的整合。例如，在细菌中，CASTs已被用于插入大型操纵子和生物合成途径，这些技术在高通量基因组工程中展现出独特的应用价值。

此外，基于碱基编辑（base editing）的方法也在基因组工程中得到了广泛应用。碱基编辑器（base editors, BEs）通过将催化失活的Cas蛋白（如dCas或nCas）与腺嘌呤或胞嘧啶脱氨酶融合，实现了在不产生DSB的情况下进行单核苷酸替换。尽管碱基编辑依赖于邻近的PAM序列，且可能存在脱靶效应，但其在细菌全基因组必需性筛选中的应用已经证明了其有效性。近年来，碱基编辑技术被用于实现细菌中多达十个基因的并行编辑，显示出其在高通量基因组工程中的巨大潜力。例如，在Corynebacterium glutamicum中，研究人员利用碱基编辑技术实现了对94个非必需转录因子的无创性失活，编辑效率超过50%，为基因组工程提供了新的工具选择。

在基因表达调控方面，基于Cas蛋白的CRISPRi和CRISPRa技术（即CRISPR干扰和激活）也成为重要的工具。这些技术通过将催化失活的Cas蛋白与效应蛋白（如激活因子或抑制因子）结合，实现对目标基因的精确调控。CRISPRi和CRISPRa技术在高通量筛选中表现出色，尤其适用于大规模的基因组研究。一些最新的研究还结合了RNA靶向的Cas13蛋白，实现了不依赖PAM序列的翻译调控，进一步拓展了基因表达调控的范围。这些方法在微生物和哺乳动物细胞中均显示出良好的应用前景，为基因组工程提供了更多选择。

为了实现高通量和自动化基因组工程，科学家们也在探索更小规模的实验平台，如微流控技术。微流控设备能够将传统的基因组编辑流程微型化，从而支持更高通量的实验操作。例如，一些研究团队已经成功将基于GGA的质粒构建和热休克转化技术应用到纳升级别的实验中。此外，结合CRISPR/Cas9和λ红重组技术，科学家们在微流控设备上实现了对多达100种大肠杆菌菌株的自动化并行编辑。这些技术的应用不仅提高了实验效率，还为基因组工程的自动化提供了新的方向。

在生物制造设施（biofoundries）的建设方面，越来越多的研究团队开始开发整合自动化流程的平台，以实现从设计到测试的完整DBTL（设计-构建-测试-学习）循环。这些设施通常由多种分子生物学、微生物学、生物信息学和自动化技术组成，能够以最小的人工干预完成大规模的基因组工程任务。目前，一些先进的biofoundry平台已经开始用于高通量的基因工程实验，例如在德国的Forschungszentrum Jülich建立的AutoBioTech平台，该平台包含14种自动化设备，用于无人工干预的菌株构建。此外，一些研究团队还开发了针对特定生物体的自动化系统，如用于酵母的iBioFoundry平台和用于植物的FAST-PB平台，这些系统通过结合不同的基因编辑技术，实现了高效的高通量工程化改造。

随着这些技术的不断成熟，基因组工程正逐步向自动化和高通量方向发展。然而，实验室自动化仍然需要大量的资金投入，因此，开发能够在实验室尺度上实现更高通量或并行编辑的方法同样重要。这些技术的结合不仅提高了基因组工程的效率，还为生物技术领域提供了更广泛的工具选择。未来，随着人工智能和自动化技术的进一步发展，基因组工程有望实现更加智能化和自主化的操作流程，从而加速对生物系统的研究和应用。