CRISPR/Cas12b介导的一管式活细胞检测方法有助于在禽肉中检测沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）

《Food Bioscience》：CRISPR/Cas12b-mediated one-tube live cell assay facilitates Salmonella Typhimurium detection in poultry meat

　　CRISPR/Cas12b结合酶切重组扩增（ERA）的一管式快速检测方法，通过PMA预处理抑制死菌DNA干扰，37℃扩增结合60℃Cas12b活化的温度分区设计，实现沙门氏菌Typhimurium的高灵敏度检测（1pg/μL DNA，1.43×102 CFU/mL鸡肉，1×102 CFU/mL鸭肉），适用于食品样本现场筛查。

　　食品安全是保障公众健康的重要环节，而食源性病原体的检测则是其中的关键技术。其中，沙门氏菌（*Salmonella*）作为常见的致病菌之一，其致病性较强，特别是在沙门氏菌属中，*Salmonella Typhimurium* 是引发沙门氏菌病的主要血清型之一，占所有病例的40%至80%。由于其传播途径广泛，主要通过污染的食物或水源经口-粪传播，且潜伏期较短（6至24小时），*S. Typhimurium* 可能导致多种症状，严重时甚至引发致命性感染。因此，建立快速、高效的检测方法对于食品安全具有重要意义。

传统的检测方法如培养法和血清分型系统，虽然在一定程度上有效，但存在诸多限制。这些方法通常需要较长时间和复杂的操作流程，且成本较高，同时对于某些特定血清型的检测灵敏度有限。近年来，基于核酸扩增的快速检测技术逐渐成为研究热点，其中聚合酶链式反应（PCR）因其高特异性和灵敏度被广泛应用于沙门氏菌的鉴定。然而，PCR方法依赖于昂贵的热循环设备，限制了其在资源有限环境中的应用。因此，研究人员开始探索替代方案，如等温扩增技术，如环形等温扩增（LAMP）、重组酶介导扩增（RPA）和新型等温扩增技术（SRCA）等，这些技术能够在常温下快速完成扩增，具有更高的便捷性和成本效益。

重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种能够在37°C条件下实现核酸扩增的技术，其扩增时间通常为20分钟。RPA使用两种引物，并生成类似于PCR的双链DNA（dsDNA）产物。然而，由于RPA技术对引物标记的要求较高，导致其成本增加，同时也容易出现假阳性结果。为了克服这些缺点，研究者提出了酶促重组酶扩增（ERA）技术，它在保持与RPA相似功能的同时，降低了引物标记的复杂性，使得检测方法更加经济实惠。ERA技术不仅支持荧光检测，还可以结合侧流试纸等其他检测模式，进一步提高了检测的灵活性和实用性。

CRISPR/Cas12b（C2C1）是一种新型的基因编辑工具，其在病原体检测中的应用也引起了广泛关注。CRISPR/Cas12b系统能够通过RNA引导识别目标DNA，并在识别后触发单链DNA的非特异性切割。这种特性使得CRISPR/Cas12b系统在检测过程中具有更高的特异性和灵敏度。此外，CRISPR/Cas12b系统还能够实现与等温扩增技术的结合，从而在单一反应管中完成扩增和检测的全过程。这不仅简化了实验操作，还提高了检测效率，使得结果更容易被观察和分析。

为了进一步提高检测的准确性，研究人员引入了碘化丙啶单甲酯（PMA）这一种光敏核酸染料。PMA能够修饰自由核酸，但无法穿透活细胞的完整细胞膜。因此，PMA处理可以有效抑制来自死菌或自由核酸的扩增，而不会影响活细胞内核酸的扩增过程。这一特性使得PMA成为检测活细胞的重要工具，特别是在食品样本中，能够减少非目标DNA的干扰，提高检测的可靠性。

本研究提出了一种基于CRISPR/Cas12b和PMA的新型快速检测方法——PMA-ERA-Cas12b。该方法结合了ERA技术的等温扩增优势和CRISPR/Cas12b的高特异性识别能力，能够在单一反应管中完成整个检测流程。PMA-ERA-Cas12b方法通过分阶段的温度控制，先在37°C条件下进行ERA扩增，以确保目标DNA的充分扩增，同时防止Cas12b酶的过早激活。随后，在60°C条件下进行CRISPR/Cas12b的检测，以实现对目标DNA的特异性识别和信号生成。这种方法不仅提高了检测的效率，还使得结果可以通过仪器或肉眼直接观察，进一步增强了其应用价值。

在实验过程中，研究人员选择了*Salmonella Typhimurium*（CICC21483）作为正样本，用于系统优化。同时，还选取了8种其他沙门氏菌和9种非沙门氏菌作为干扰菌株，以评估PMA-ERA-Cas12b方法的特异性。所有菌株均在胰化大豆肉汤（TSB）中培养，随后在木糖赖氨酸去氧胆酸（XLD）琼脂上计数沙门氏菌菌株，在普通培养基（LB）上计数非沙门氏菌菌株。提取菌株的基因组DNA后，研究人员进一步优化了PMA处理条件，并将其整合到ERA-Cas12b检测流程中，以确保方法的准确性和可靠性。

实验结果显示，PMA-ERA-Cas12b方法能够检测纯培养的*Salmonella Typhimurium* DNA样本，最低检测浓度为1 pg/μL。在未富集条件下，该方法在添加了鸡肉样本中检测到*Salmonella Typhimurium* 的最低浓度为1.43 × 102 CFU/mL，而在添加了鸭肉样本中检测到的最低浓度为1 × 102 CFU/mL。这些数据表明，PMA-ERA-Cas12b方法在实际应用中具有较高的灵敏度和特异性，能够有效检测食品中的活菌。

此外，该方法还具有操作简便、成本低廉、检测速度快等优点。通过将ERA和CRISPR/Cas12b技术结合，研究人员成功构建了一种适用于多种检测场景的快速检测方法。该方法不仅能够用于沙门氏菌的检测，还可能扩展到其他病原体、病毒和耐药基因的检测领域。在实际应用中，PMA-ERA-Cas12b方法能够提供一种全新的检测手段，使得食品安全的保障更加高效和可靠。

在讨论部分，研究人员进一步分析了非伤寒沙门氏菌（NTS）感染的全球公共卫生影响。NTS感染是当前公共卫生领域的重要问题之一，其中*Salmonella Typhimurium* 是主要的致病菌之一。传统的检测方法虽然在一定程度上能够满足需求，但其在操作流程、成本和时间上的限制仍然存在。因此，基于CRISPR/Cas12b和ERA技术的新型检测方法具有重要的应用前景。

在结论部分，研究人员总结了PMA-ERA-Cas12b方法的优势。该方法不仅实现了快速、高效的检测，还通过PMA处理提高了检测的准确性。此外，通过单一反应管的设计，使得检测流程更加简便，同时结合了多种检测模式，如荧光检测和肉眼检测，提高了方法的适用性。这些成果为食品安全检测提供了新的解决方案，有助于提高食品安全水平，减少食源性疾病的传播风险。

在研究过程中，研究人员还注意到一些未引用的参考文献，这些文献可能对当前研究提供了重要的背景信息或技术支持。此外，研究数据将在需要时提供，以确保研究的透明性和可重复性。研究人员还声明，他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本研究的公正性，以确保研究的独立性和科学性。

总之，PMA-ERA-Cas12b方法的建立和优化为食品安全检测提供了一种全新的解决方案。通过结合ERA和CRISPR/Cas12b技术，该方法不仅提高了检测的效率和准确性，还简化了实验流程，使得检测更加便捷和实用。这一研究为未来食品安全检测技术的发展提供了重要的参考，同时也为相关领域的研究提供了新的思路和方法。