综述：不断发展的HPV诊断技术：当前实践与未来前沿

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Evolving HPV diagnostics: current practice and future frontiers

　　HPV检测技术从传统方法向新兴技术发展，包括NGS、CRISPR、IAT和液体活检，同时采样方式创新如自取样和液体活检提升便利性，AI与大数据优化分析，以降低癌症负担。

　　HPV感染是导致宫颈癌的主要病原体之一，凸显了早期筛查和诊断在降低相关疾病发病率和死亡率中的重要性。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，HPV检测技术经历了显著的变革，从传统的细胞学检测方法（如巴氏涂片和液基细胞学）逐步过渡到更为先进的、以患者为中心的检测手段。本文旨在全面回顾当前HPV检测方法的进展，探讨其在临床应用中的优势与局限，并重点分析新兴技术在提高诊断精度、缩短检测周期以及实现现场检测（point-of-care, POCT）方面的潜力。

HPV是一种小型、无包膜、双链DNA病毒，其基因组包含超过200个亚型。根据其致癌潜能，这些亚型可分为低风险型和高风险型。低风险型（如HPV6和11）通常与良性病变如生殖器疣有关，而高风险型（hr-HPV）则与多种恶性肿瘤密切相关，包括宫颈癌、肛门癌、口咽癌和阴茎癌等。目前，世界卫生组织（WHO）已确认12种高风险型HPV，其中HPV16和18是导致全球超过70%宫颈癌病例的主要亚型。这些高风险型HPV不仅对宫颈癌构成威胁，还与多种其他癌症相关，因此，提升其检测的准确性和可及性对于全球公共卫生具有重要意义。

在HPV筛查领域，传统方法如巴氏涂片和液基细胞学虽然成本较低且易于实施，但其敏感性和特异性相对不足，容易导致漏诊或误诊。相比之下，基于HPV核酸的检测技术，如核酸杂交信号放大技术和聚合酶链式反应（PCR）技术，显著提高了检测的准确性和敏感性，对宫颈癌的防控作出了重要贡献。当前，临床中广泛采用的HPV分子检测技术主要包括核酸杂交信号放大技术（如Hybrid Capture 2, HC2）和核酸扩增技术及其衍生方法（如PCR技术）。这些技术主要针对HPV基因组DNA或mRNA，直接检测HPV感染及其分型，从而为诊断提供更为可靠的依据。

尽管传统方法在HPV检测中取得了显著进展，但它们仍面临诸多挑战。例如，HC2缺乏内部对照，可能导致假阴性或假阳性结果，限制了其在精准筛查中的应用。而基于PCR的方法虽然具有较高的敏感性，但其特异性在检测低级别病变（如CIN2以下）时往往不足，容易造成过度诊断和不必要的临床干预。此外，这些方法通常依赖于侵入性采样和复杂的实验室设备，使得其在资源匮乏地区难以普及。这些限制凸显了开发更精确、非侵入性且易于推广的HPV检测策略的重要性。

近年来，随着分子生物学技术的不断进步，一系列新兴技术被引入到HPV检测领域，为未来诊断方法提供了新的思路。其中包括下一代测序（NGS）、数字PCR（ddPCR）、CRISPR/Cas系统、等温扩增技术（IAT）以及人工智能（AI）与HPV筛查的结合。这些新兴技术不仅在提高检测的敏感性和特异性方面表现出色，还具备更高的通量和更强的适应性，特别是在资源匮乏地区的应用潜力巨大。

NGS技术通过高通量测序，能够对HPV基因组进行详细的分析，从而识别不同亚型及其遗传变异，如突变、插入和缺失。这为理解病毒的变异和致病性提供了重要的信息。然而，NGS技术对样本处理和数据解读有较高的技术要求，且检测成本较高，限制了其在大规模筛查中的应用。尽管如此，随着测序成本的下降和数据分析流程的优化，NGS在临床中的应用前景广阔，尤其是在需要高分辨率分型和病毒整合分析的研究和筛查中。

ddPCR技术则通过将PCR反应混合物分为数万个微小的液滴，实现对HPV DNA/RNA的绝对定量。该方法无需依赖标准曲线，具有极高的灵敏度，能够检测低拷贝数的HPV感染。ddPCR在检测宫颈癌和癌前病变方面表现出色，但其操作复杂性和高昂的设备成本限制了其在基层医疗环境中的普及。然而，随着技术的进一步优化，ddPCR有望成为一种更加便捷、精准的检测手段，特别是在需要快速、自动化检测的场景中。

CRISPR/Cas系统在HPV检测中展现了强大的潜力。CRISPR-Cas12和Cas13分别通过DNA和RNA水平的检测，提供了更加灵敏和多样化的诊断方法。Cas12系统利用其非特异性切割活性，能够在检测HPV DNA的同时实现信号放大，从而提高检测的准确性。而Cas13系统则专注于RNA水平的检测，能够识别活跃的HPV感染状态，提供更深层次的生物学信息。尽管这些技术在实验室环境中表现优异，但要实现真正的POCT应用，还需要进一步的技术优化，包括提高试剂的稳定性、简化操作流程以及降低检测成本。

等温扩增技术（IAT）如环形等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等，因其能够在恒定温度下进行扩增，简化了操作流程，降低了对复杂设备的依赖。LAMP技术通过特异性引物和DNA聚合酶在恒温条件下高效扩增目标DNA序列，适用于快速、低成本的检测需求。而RPA技术则在更低的温度下完成扩增，进一步提高了检测的便捷性。这些技术在基层医疗和现场检测中展现出极大的应用潜力，特别是在资源有限的地区。

与此同时，非侵入性采样方法也在不断进步。例如，自取阴道拭子和基于液体活检的检测方法（如尿液、血液或外泌体）正在提高检测的接受度和覆盖范围。自取拭子方法通过减少医疗干预和提高患者参与度，有效提升了筛查的可及性。而液体活检方法则通过检测血液、尿液或唾液中的循环游离DNA（cfDNA）或外泌体（EVs），提供了非侵入性、便捷的筛查手段。这些方法不仅提高了患者对筛查的接受度，还为大规模筛查提供了可行的路径。

人工智能（AI）和计算生物学在HPV检测中的应用也日益受到重视。AI技术能够处理和分析复杂的分子数据，识别传统方法难以发现的生物标志物模式。例如，DeepHPV模型通过深度学习技术，能够预测HPV整合，提高诊断的准确性。此外，结合AI和机器学习的算法可以用于分析cfDNA或EVs中的甲基化模式，从而实现对HPV相关疾病风险的分层评估。这些技术的应用，不仅提升了检测的智能化水平，还为个性化诊断和精准治疗提供了新的方向。

综上所述，尽管传统HPV检测方法在临床中发挥了重要作用，但其局限性也日益凸显。新兴技术如NGS、ddPCR、CRISPR/Cas系统和等温扩增技术，为HPV检测提供了更高的精度和更便捷的操作流程。同时，非侵入性采样方法如自取拭子和液体活检，也显著提高了筛查的可及性和患者接受度。人工智能和计算生物学的引入，进一步推动了HPV检测的智能化发展。未来，随着这些技术的不断优化和普及，HPV检测有望实现更高的准确性、更广泛的覆盖以及更便捷的操作，从而为全球HPV相关疾病的防控提供强有力的支持。