一种具有环核酸酶活性的病毒蛋白可以降解CRISPR系统的第二信使cA4

《Biochemical Journal》：A viral SAVED protein with ring nuclease activity degrades the CRISPR second messenger cA 4

　　病毒Thermocrinus Great Boiling Spring病毒（TGBSV）编码的SAVED结构域蛋白AcrIII-2可特异性降解cA4环二聚体，抑制宿主CRISPR效应器，其双分子体结构通过X射线晶体学解析，活性位点与CalpL蛋白高度相似。该研究首次揭示病毒利用SAVED结构域作为抗CRISPR环核酸酶的机制。

　　在自然界中，病毒与宿主之间存在着长期的相互作用和进化博弈。这种互动不仅限于简单的寄生关系，还涉及复杂的防御机制与反防御策略。细菌为了抵御噬菌体的侵袭，进化出了多种防御系统，其中CRISPR-Cas系统因其强大的适应性免疫功能而备受关注。与此同时，噬菌体也在不断演化出新的策略来逃避这些防御机制，其中一类重要的机制就是通过编码“反CRISPR”蛋白（Acr）来干扰宿主的CRISPR-Cas防御系统。近期，一项研究揭示了一种新型的Acr蛋白，它利用了宿主CRISPR系统中的SAVED结构域，作为环状核苷酸水解酶来中和宿主的防御信号分子，从而抑制CRISPR-Cas的抗病毒功能。这项发现不仅加深了我们对病毒如何对抗宿主防御系统的理解，也为进一步研究病毒与宿主之间的分子层面互动提供了新的视角。

### CRISPR-Cas系统的防御机制

CRISPR-Cas系统是一种由细菌开发的适应性免疫机制，能够识别并摧毁入侵的噬菌体DNA或RNA。其中，Type III CRISPR系统因其能够识别RNA并生成环状寡腺苷酸（cyclic oligoadenylate，简称cOA）信号分子而受到特别关注。当Type III CRISPR系统检测到外源RNA时，它会通过Cas10蛋白合成cOA分子，如cA?（cyclic tetra-adenylate）。这些cOA分子会激活一系列辅助效应蛋白，从而引发多种抗病毒反应，包括转录调控、RNA降解和膜电位破坏等。这些效应蛋白通常包含与cOA结合的传感器结构域，如CRISPR-associated Rossmann fold（CARF）和SAVED（SMODS associated and fused to various effectors domain）结构域。SAVED结构域是Type III CRISPR系统中常见的结构域，它在cA?的结合和激活过程中起着关键作用。例如，在CalpL蛋白中，SAVED结构域能够结合cA?，引发蛋白丝状化，并激活其N端的Lon蛋白酶结构域，最终导致抗σ因子CalpT的降解，从而释放σ因子CalpS，启动转录重塑以对抗噬菌体感染。

### 病毒如何利用SAVED结构域

在本研究中，科学家们发现了一种来自热泉噬菌体TGBSV的病毒编码蛋白，其结构与CalpL的SAVED结构域高度相似，但功能却截然不同。该蛋白被命名为AcrIII-2，即“第二类反CRISPR蛋白”。AcrIII-2能够结合并降解cA?，将其分解为短链线性产物，如A?-P和A?-P。这种降解机制与CalpL的环状核苷酸水解活性高度相似，表明AcrIII-2可能通过模仿宿主的防御机制来干扰其功能。具体而言，AcrIII-2能够以二聚体形式结合cA?，并在两个亚基之间共享活性位点，从而实现高效的水解反应。这种结构和功能上的相似性表明，病毒可能利用了宿主CRISPR系统的SAVED结构域作为其反防御策略的一部分，通过将其改造为环状核苷酸水解酶，从而削弱宿主的防御能力。

### AcrIII-2的结构和功能验证

为了进一步验证AcrIII-2的功能，研究团队通过多种实验手段进行了详细分析。首先，他们利用HPLC（高效液相色谱）和质谱技术对AcrIII-2与cA?的反应产物进行了鉴定。实验结果显示，AcrIII-2能够在短时间内将cA?降解为A?-P和A?-P等中间产物，并最终生成A?-P作为主要的水解产物。此外，通过分析不同突变体的活性，研究人员发现多个保守的活性位点残基（如H128、S194、R96、K99和Q178）对于AcrIII-2的水解功能至关重要。其中，R96E、K99E和H128A突变体完全失去了环状核苷酸水解活性，而S194A突变体则表现出非常弱的活性，这表明这些残基在AcrIII-2的活性位点中具有不同的功能角色。Q178A突变体则能够将cA?降解为A?-P，但产生的A?-P量较少，这可能与其在水解后的线性产物中催化环状磷酸基团的断裂有关。

为了进一步确认AcrIII-2是否依赖于其二聚体结构进行cA?的降解，研究团队设计了一项“亚基混合实验”。他们将两个无法单独水解cA?的突变体（如H128A和R96E）进行混合，并测试其在cA?存在下的活性恢复情况。结果表明，当这两个突变体混合后，AcrIII-2的水解活性得以恢复，说明其活性位点是跨亚基的复合结构。这一发现与CalpL的水解机制类似，表明AcrIII-2和CalpL都依赖于其二聚体或更高阶的多聚体结构来进行高效的cA?降解。

### AcrIII-2的抑制作用

除了对cA?的降解能力，AcrIII-2还表现出对多种cA?激活的效应蛋白的抑制作用。研究团队测试了AcrIII-2对TTHB144（一种cA?激活的核糖核酸酶）和CalpL（一种cA?激活的蛋白酶）的影响。在TTHB144的实验中，当AcrIII-2与cA?以12.5倍的摩尔比混合时，TTHB144仍能被完全激活，表明此时cA?的浓度足够维持效应蛋白的活性。然而，当AcrIII-2与cA?的摩尔比超过6倍时，TTHB144的活性被显著抑制，这说明AcrIII-2能够通过消耗cA?来阻止效应蛋白的激活。类似地，在CalpL的实验中，AcrIII-2能够阻止CalpL对CalpT的切割，从而抑制其引发的转录重塑反应。这些实验结果表明，AcrIII-2不仅能够直接降解cA?，还能通过干扰其对效应蛋白的激活来削弱CRISPR-Cas系统的抗病毒能力。

### AcrIII-2的进化意义

AcrIII-2的发现揭示了病毒如何通过“遗传掠夺”（genetic scavenging）的方式利用宿主的防御结构域。SAVED结构域原本是CRISPR-Cas系统的一部分，用于识别和激活效应蛋白。然而，TGBSV病毒将其改造为一种反防御蛋白，使其能够结合并降解cA?，从而阻止宿主的免疫反应。这种策略表明，病毒不仅能够通过直接攻击宿主的防御机制来实现其生存，还能够利用宿主自身的分子结构作为工具，形成一种更为精妙的反防御策略。这种现象在CRISPR-Cas系统的研究中并不罕见，许多噬菌体已经进化出类似的Acr蛋白，如AcrIII-1，它能够直接水解cA?，从而抑制宿主的防御反应。然而，AcrIII-2的发现为这一领域增添了新的成员，并进一步表明，病毒可能利用了宿主CRISPR系统的多种结构域作为反防御工具。

### 未解决的问题与未来方向

尽管AcrIII-2的功能已经通过多种实验手段得到验证，但其在宿主细胞内的实际作用仍需进一步研究。目前的研究主要集中在体外实验，而体内实验尚未完成。由于AcrIII-2具有高温活性，这使得其在实验室条件下难以有效表达和功能测试。因此，研究团队提出了一个可能的解释：在实际的病毒-宿主系统中，AcrIII-2可能通过与宿主CRISPR系统的其他效应蛋白协同作用，从而更有效地中和宿主的防御信号。此外，研究团队还发现，某些细菌基因组中存在非CRISPR效应蛋白的SAVED结构域，这可能表明这些结构域在某些情况下也具有环状核苷酸水解活性。因此，他们建议将这些结构域命名为“Crn5”（CRISPR ring nuclease 5），以强调其在CRISPR系统中的潜在作用。

### 结论

AcrIII-2的发现为理解病毒如何对抗宿主CRISPR-Cas系统提供了新的视角。它不仅展示了病毒如何利用宿主的防御结构域，还揭示了反防御蛋白的多样化策略。通过结合和降解cA?，AcrIII-2能够有效地抑制多种cA?激活的效应蛋白，从而削弱宿主的免疫反应。这一研究不仅有助于揭示CRISPR-Cas系统的复杂性，也为开发新的抗病毒策略提供了理论依据。未来的研究可以进一步探索AcrIII-2在宿主细胞内的实际作用，以及其与其他Acr蛋白之间的相互作用，以更全面地理解病毒与宿主之间的动态平衡。