基于VQR、VRER和EQR变体的CRISPR-Cas9系统扩展PAM（广泛匹配）兼容性的设计规则

《The Journal of Physical Chemistry B》：Design Rules for Expanding PAM Compatibility in CRISPR-Cas9 from the VQR, VRER and EQR variants

　　PAM识别机制研究表明，CRISPR-Cas9变体VQR/VRER/EQR的非标准PAM结合依赖直接接触与远程网络协同作用，D1135 V/E置换通过K1107和S1109稳定DNA结合，而单纯R→Q替换破坏结合裂隙和REC3动态，影响效率。摘要分隔符：

　　

扩展CRISPR-Cas9能够识别的原间隔序列邻接基序（Protospacer Adjacent Motifs，PAMs）的范围对于拓展基因组编辑的应用至关重要。在本文中，我们结合分子动力学模拟、图论和中心性分析，研究了三种针对非典型PAMs的Cas9变体——VQR、VRER和EQR——的PAM识别机制。研究表明，高效的识别不仅取决于PAM相互作用残基与DNA之间的直接接触，还依赖于一个远端网络，该网络能够稳定PAM结合结构，并维持与REC3的远程通信，而REC3则负责将信号传递给HNH核酸酶。D1135位置的V/E替换起着关键作用：它使得K1107能够稳定地结合DNA，并通过S1109保持与DNA磷酸基团的相互作用，从而确保PAM的稳定结合。相比之下，仅在PAM接触残基处发生R到Q替换的变体虽然被认为能增强对腺嘌呤的识别能力，但会破坏PAM结合结构，干扰REC3的动态行为，并破坏其与HNH的别构耦合。这些发现共同表明，PAM的识别需要局部稳定、远端耦合以及熵的调节，而不仅仅是碱基特异性接触的简单结果。这一框架为设计具有更广泛PAM兼容性和更高编辑效率的Cas9变体提供了指导原则。