一种“一对一多”的金纳米粒子增强型CRISPR/Cas12a（AuNP-CRISPR）免疫传感器，用于灵敏检测恩诺沙星

《LWT》：A “one-to-multiple” gold nanoparticle-enhanced CRISPR/Cas12a (AuNP-CRISPR) immunosensor for the sensitive detection of enrofloxacin

　　基于金纳米颗粒和CRISPR/Cas12a系统的恩诺沙星竞争免疫传感器研究。采用AuNP-BSA-ENR/ssDNA探针实现竞争结合与CRISPR信号放大，检测限达1 ng/mL，在鱼和池塘水样本中验证了可行性与回收率（91.0%-115.2%）。

　　近年来，食品安全问题日益受到关注，尤其是抗生素残留的检测。抗生素在畜牧业和水产养殖等领域的广泛应用，使得其在食品中的残留成为潜在的健康风险。其中，恩诺沙星（Enrofloxacin，简称ENR）作为一种广谱的氟喹诺酮类抗生素，广泛用于动物疾病的治疗。然而，长期摄入含有ENR残留的动物产品可能导致过敏反应、肠道菌群失衡以及药物耐受性的产生。因此，开发一种高效、准确且易于应用的ENR检测方法显得尤为迫切。

传统的ENR检测方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和免疫层析法。这些方法各有优劣。仪器分析方法虽然具有较高的准确性和灵敏度，但往往需要复杂的样品预处理、昂贵的设备和专业的操作人员，因此在日常监测和偏远地区的应用受到限制。而ELISA和免疫层析法虽然操作简便、快速，但灵敏度较低，难以满足对低浓度ENR的检测需求。为了提高检测灵敏度，研究人员在过去几十年中开发了多种基于不同信号放大策略的生物传感器，特别是利用各种新型纳米材料，如金纳米颗粒（AuNPs）进行信号增强。例如，有研究开发了一种基于电化学发光的生物传感器，其通过聚乙炔材料的天线效应实现信号放大，可检测ENR的最低检测限（LOD）达到3×10^-15 mol/L。

随着CRISPR技术的兴起，其在生物传感器领域的应用也逐渐增多。CRISPR/Cas12a系统因其高度的靶向特异性和切割效率，成为开发高灵敏度生物传感器的重要工具。当该系统被特定的双链DNA（dsDNA）或单链DNA（ssDNA）激活后，可以非特异性地切割附近的ssDNA，这一特性为设计多功能的CRISPR生物传感器提供了可能性。此外，CRISPR/Cas12a系统本身具有酶促信号放大能力，能够有效提高检测灵敏度。然而，由于CRISPR/Cas12a系统只能通过靶向核酸激活其切割功能，目前大多数基于该系统的生物传感器主要用于病原体、病毒等核酸相关靶标的检测，而非核酸靶标的检测仍存在不足。

因此，开发一种能够适用于非核酸靶标的、更加通用且高灵敏度的CRISPR/Cas12a平台具有重要意义。在这一背景下，本研究提出了一种基于金纳米颗粒增强的CRISPR/Cas12a系统（AuNP-CRISPR）的荧光免疫传感器，用于ENR的检测。该传感器利用磁性纳米颗粒（MNPs）表面修饰的ENR抗体作为结合位点，同时使用修饰了牛血清白蛋白-ENR和ssDNA的AuNPs作为竞争物和CRISPR/Cas12a激活剂。在没有ENR的情况下，AuNPs-BSA-ENR/ssDNA能够结合到MNPs-Ab表面，激活CRISPR/Cas12a系统的切割活性，从而降解荧光探针，释放FAM荧光标记物，使其远离BHQB-1淬灭剂，产生可测量的荧光信号。而在ENR存在的情况下，ENR会占据大部分结合位点，抑制AuNPs-BSA-ENR/ssDNA的结合，导致CRISPR/Cas12a系统未被充分激活，荧光信号较弱。因此，该传感器的荧光强度与CRISPR/Cas12a系统的切割活性直接相关，能够实现对ENR浓度的定量检测。

本研究中，AuNPs因其较大的比表面积、易于合成与修饰以及良好的生物相容性，被广泛用于信号增强。此外，AuNPs的高ssDNA负载能力使得单个AuNPs-BSA-ENR/ssDNA能够激活多个Cas12a蛋白，实现信号的级联放大。这种信号放大机制显著提高了检测灵敏度，同时避免了传统CRISPR检测平台中复杂的核酸预扩增过程。实验结果表明，该方法的最低检测限为1 ng/mL，具有较高的灵敏度，且适用于食品和环境样本的检测。在对实际样品的检测中，回收率范围在91.0%至115.2%之间，显示出良好的应用潜力。

为了进一步验证该传感器的可行性，本研究还对其检测性能进行了系统评估。首先，通过检测其他常见抗生素（如氯霉素、多西环素、四环素、磺胺甲噁唑和环丙沙星）的荧光响应，评估了其选择性。结果显示，只有环丙沙星（CIP）与ENR的荧光信号变化显著，而其他抗生素的荧光响应与空白对照无明显差异，表明该传感器能够有效区分ENR与其他抗生素。尽管CIP与ENR结构相似，导致一定的交叉反应，但根据中国国家标准和欧盟法规，ENR和CIP通常需要同时检测，因此这种交叉反应并不影响该方法的适用性。未来的工作应进一步优化生物受体的选择性，以提高检测的准确性。

此外，本研究还评估了该传感器的重复性、可重复性和稳定性。通过多次重复检测100 ng/mL的ENR样本，结果显示该方法具有良好的重复性，相对标准偏差（RSD）仅为2.58%。同时，通过制备5批次的MNPs-Ab和AuNPs-BSA-ENR/ssDNA探针，评估了其批次一致性，结果显示RSD为6.24%，表明该方法具有一定的可重复性。在稳定性方面，MNPs-Ab和AuNPs-BSA-ENR/ssDNA探针在4°C条件下储存15天后，荧光信号变化不显著，显示出良好的稳定性。然而，在25°C条件下储存9天后，AuNPs-BSA-ENR/ssDNA探针出现严重聚集，导致荧光信号显著下降，表明其在高温下的稳定性较差。因此，建议将MNPs-Ab和AuNPs-BSA-ENR/ssDNA探针储存于4°C环境中，以保持最佳的稳定性。

在实际样品检测方面，本研究对鱼肉提取物和池塘水样进行了ENR残留的检测。结果显示，该方法在不同浓度的ENR加入下，回收率范围在91.0%至100.4%之间，显示出良好的适用性。同时，该方法在高盐条件下仍能保持较高的检测性能，说明其对pH和离子强度具有一定的耐受性。尽管如此，复杂的样品基质可能影响实际检测的准确性，因此未来的研究需要进一步优化纳米探针的表面修饰，以提高其在复杂基质中的稳定性。

总体而言，本研究开发的AuNP-CRISPR免疫传感器在ENR检测中表现出良好的性能。该方法不仅提高了检测的灵敏度，还实现了对非核酸靶标的检测，具有较高的通用性。然而，目前该方法仍依赖于手动操作，且需要复杂的荧光分析仪进行信号测量，限制了其在现场检测中的应用。因此，未来的研究应关注该方法与自动化、用户友好型和便携式设备的结合，如微流控芯片和便携式荧光分析仪，以提高其实际应用价值。此外，目前该方法尚未实现对多种靶标的多重检测，而CRISPR/Cas12a系统的非特异性切割特性使得多重检测较为困难。因此，未来的工作可以探索和应用具有不同切割特性的Cas蛋白，以实现多重检测。最后，尽管AuNPs和MNPs在较宽的pH和离子强度范围内具有良好的耐受性，但在更复杂的基质中仍可能存在非特异性吸附和稳定性问题，因此需要进一步改进纳米探针的表面修饰，以提高其在复杂基质中的稳定性。

综上所述，本研究开发的AuNP-CRISPR免疫传感器为ENR的高灵敏度检测提供了一种新的解决方案。该方法不仅具有良好的灵敏度和选择性，还具备较高的通用性和稳定性，适用于食品和环境样本的检测。尽管存在一些局限性，如对自动化设备的依赖和在多重检测方面的不足，但其在实际应用中展现出广阔前景。未来的工作应进一步优化该方法，以提高其在实际检测中的适用性，并探索其在其他领域的应用潜力。