玉米单倍体胚性培养体系的建立及其在基因编辑中的应用：染色体稳定性、加倍效率与编辑优势分析

《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant》：Haploid embryogenic cultures of maize (Zea mays L.): stability, doubling efficiency, and use in gene editing

　　语 为解决单倍体组织培养中染色体不稳定性及基因编辑效率低的问题，研究人员以玉米自交系LH244为材料，系统评估了单倍体胚性愈伤组织的染色体稳定性、农杆菌介导的转化效率及CRISPR/Cas12a（LbCpf1）编辑效果。结果表明，单倍体培养物在6个月内保持稳定的单倍性，转化效率与二倍体相当；秋水仙素处理可高效诱导染色体加倍，且单倍体来源的编辑植株主要呈现纯合等位基因型。该研究为利用单倍体培养体系开展隐性突变筛选和复杂基因组编辑提供了技术框架。

　　

玉米作为全球重要的粮食作物，其遗传改良技术的创新对育种效率提升至关重要。传统育种依赖多代自交纯合优良基因型，耗时漫长。单倍体技术可通过染色体加倍快速获得纯合系，显著缩短育种周期。然而，单倍体细胞在体外培养中常出现自发加倍，导致其难以维持单倍性，限制了在基因功能研究和编辑中的应用。此外，现有体内单倍体编辑方法（如HI-Edit）虽能同步实现单倍体诱导与编辑，但效率较低，且难以实现复杂染色体操作。因此，建立稳定的单倍体体外培养体系，并探索其在基因编辑中的潜力，成为玉米遗传改良的迫切需求。

本研究以玉米自交系LH244为模型，通过幼苗诱导胚性愈伤组织，系统评估了单倍体培养物的染色体稳定性、转化效率及CRISPR/Cas12a编辑效果。研究首次将单倍体胚性愈伤体系与多靶点基因编辑结合，为玉米功能基因组学和精准育种提供了新策略。

关键技术方法概述

研究利用LH244单倍体与二倍体幼苗诱导胚性愈伤组织，通过流式细胞术持续监测染色体稳定性。采用农杆菌介导法转化含Cas12a（LbCpf1）及靶向染色体3和6的gRNA载体，以paromomycin筛选转基因细胞系。单倍体转基因愈伤经秋水仙素处理诱导加倍，二倍体对照进行模拟处理。通过Taqman检测转基因拷贝数，Illumina测序分析ch3_reg1_1.1靶点编辑效率。

研究结果

1. 单倍体胚性玉米组织培养物的染色体稳定性

单倍体愈伤组织在培养3个月内保持完全单倍性，6个月后仍以单倍体为主（38%细胞系出现混倍体），而二倍体对照始终稳定。实验二的30个单倍体细胞系中仅1例出现混倍体，证实LH244单倍体培养物具有优良的染色体稳定性。

2. 单倍体与二倍体胚性愈伤组织的转化频率

三组转化实验显示，单倍体与二倍体愈伤组织的平均转化频率分别为2.1和2.4事件/克组织，无显著差异（p=0.96）。表明单倍体状态不影响农杆菌转化效率，为其编辑应用奠定基础。

3. 胚性愈伤组织的自发和秋水仙素诱导加倍

秋水仙素处理使单倍体转基因事件中纯单倍体比例从52%降至9%，二倍体/四倍体比例显著上升；二倍体对照在模拟处理后保持稳定。尽管部分组织存活率下降，但证明秋水仙素处理可有效诱导染色体加倍。

4. 再生植株的染色体倍性

单倍体来源的再生植株经秋水仙素处理后，二倍体/四倍体比例大幅增加，而二倍体对照植株倍性稳定。其中仅单倍体来源植株出现叶绿素缺陷型，提示单倍体状态可即时显现隐性突变。

5. T0植株中ch3_reg1_1.1 gRNA位点的简单编辑

单倍体与二倍体编辑效率分别达91.0%和85.7%，且编辑植株中突变序列占比超90%。单倍体来源植株72.1%为纯合等位基因型，二倍体来源73.3%为双等位基因型，符合单倍体编辑后加倍产生纯合子的理论预期。一例四等位基因事件推测为编辑后异常加倍所致。

结论与意义

本研究证实玉米单倍体胚性愈伤组织具备良好的染色体稳定性和可编辑性。秋水仙素加倍方案虽需优化，但为隐性突变筛选和复杂编辑提供了新平台。单倍体编辑产生的纯合植株可规避嵌合体问题，加速性状固定。未来可借助该体系开展染色体倒位、靶向整合等研究，推动玉米精准育种发展。论文发表于《In Vitro Cellular & Developmental Biology- Plant》，为作物生物技术创新提供了重要参考。