磁控双模式比色/光热CRISPR/Cas12a-Au@PtNPs平台用于B组链球菌的即时检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Magnetically Controlled Dual-Mode Colorimetric/Photothermal CRISPR/Cas12a-Au@PtNPs Platform for Point-of-Care Detection of Group B Streptococcus

　　GBS快速检测双模式生物传感平台开发，整合CRISPR/Cas12a识别与Au@PtNPs催化氧化TMB生成颜色/近红外热响应信号，磁珠分离提升特异性，检测限103 CFU/mL，适用于资源有限地区新生儿败血症筛查。

　　本文探讨了一种新型的磁控双模生物传感平台，命名为CP-CasAuPt，用于快速、准确地检测新生儿感染的主要病原体——B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）。传统方法如培养法和核酸扩增检测在资源有限的环境中存在诸多限制，如耗时较长、灵敏度不足或依赖复杂仪器，难以满足临床对普遍筛查的需求。因此，开发一种能够克服这些缺陷的便携式诊断平台显得尤为重要。本文提出的CP-CasAuPt系统结合了CRISPR/Cas12a的序列特异性切割能力与Au@Pt纳米酶的过氧化物酶模拟活性，实现了双模信号读取，即颜色变化和近红外光热响应，从而在无需复杂设备的情况下实现可靠的检测。此外，磁珠辅助分离技术有效降低了背景干扰，提高了检测的准确性和稳定性。

GBS是一种常见的病原体，尤其在围产期阶段，它会导致早发性新生儿感染，对新生儿的健康构成严重威胁。在孕期进行GBS筛查并在分娩时使用预防性抗生素可以显著降低感染率和死亡率。然而，在资源有限的地区，现有的GBS检测方法存在诸多局限，如检测时间过长、对低浓度样本的灵敏度不足、设备依赖性强以及对专业技术人员的需求高等。这些因素使得在这些地区开展普遍筛查变得困难。目前，培养法被认为是GBS检测的金标准，但需要48至72小时才能得到结果，这对于需要快速诊断的临床场景来说不够理想。免疫检测方法虽然适用范围广，但存在抗体制备周期长和假阳性率高的问题。而基于核酸的检测技术如实时荧光定量PCR（qPCR）虽然快速且灵敏，但依赖昂贵的设备和专业的技术人员，难以在资源有限的环境中广泛应用。

为了解决这些问题，研究人员开发了一种基于CRISPR/Cas12a的便携式检测平台，利用磁珠辅助分离和Au@Pt纳米酶的催化作用，实现了颜色和光热双模信号的检测。这种双模设计不仅提高了检测的可靠性，还通过信号交叉验证减少了假阳性和假阴性的风险。Au@Pt纳米酶具有类似过氧化物酶的活性，能够在没有复杂光学设备的情况下，通过简单的温度测量实现定量检测。同时，Au@Pt纳米酶的稳定性优于传统酶，且成本较低，便于大规模应用。磁珠辅助分离技术则能够有效减少非特异性背景信号，提高检测的准确性。这些技术的结合使得CP-CasAuPt平台在复杂临床样本中表现出优异的性能。

在实验中，研究人员使用GBS作为验证对象，通过环介导等温扩增（LAMP）技术，将检测限降低至103 CFU/mL，并且在20个临床样本中，检测结果与qPCR完全一致。这表明CP-CasAuPt平台不仅具有高灵敏度和特异性，还能在不同的检测条件下保持稳定，从而适用于多样化的应用场景。此外，该平台的开发为多模分子诊断提供了一种通用策略，使检测方法更加灵活和经济，特别适合资源有限的地区使用。

CRISPR/Cas系统近年来在分子诊断领域展现出巨大的潜力，特别是在点对点检测（POCT）中。CRISPR/Cas12a因其能够识别特定的单链DNA（ssDNA）或双链DNA（dsDNA）并激活其转切割活性，成为研究的热点。研究人员利用这一特性，开发了一种“开启式”荧光检测方法，结合CRISPR/Cas12a与硫代磷酸修饰的G四链体/G三链体序列，实现了高灵敏度和特异性的检测。然而，单一模式的检测方法存在一定的局限性，如荧光信号易受背景干扰，颜色变化可能因视觉主观性而影响准确性，光热信号则缺乏直观的视觉提示，限制了其在实际应用中的直观性。

为了克服这些限制，多模检测平台通过交叉验证多个信号，提高了检测的可靠性和抗干扰能力。研究人员在之前的工作中，开发了一种基于CRISPR的生物传感器，利用辣根过氧化物酶的催化作用，实现了对耐药菌的三模式检测。然而，天然酶在实际应用中存在稳定性差、成本高和储存困难等问题。因此，寻找一种具有类似催化效率但稳定性更高、成本更低的替代方案成为研究的重点。

纳米酶作为一种新型的催化剂，因其具有类似于天然酶的活性，且具备高稳定性、易于合成和低成本等优势，成为替代天然酶的理想选择。铂纳米颗粒（PtNPs）因其具有过氧化物酶样活性，在生物传感领域被广泛应用。然而，由于PtNPs体积小，容易发生聚集，从而降低其催化活性，因此需要一种支撑材料来提高其稳定性。金纳米颗粒（AuNPs）具有较大的表面积，能够携带更多的信号分子，实现信号放大。Au@Pt纳米颗粒（Au@PtNPs）则是通过AuNPs作为种子合成的，不仅提高了纳米材料的稳定性，还增强了其过氧化物酶样活性，使其在颜色检测方面表现出更大的潜力。

本文提出的CP-CasAuPt平台，结合了CRISPR/Cas12a的序列特异性识别和转切割活性，以及Au@PtNPs的过氧化物酶模拟活性，实现了双模信号的读取。这种设计不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还通过信号交叉验证减少了假阳性和假阴性的风险。在检测过程中，当目标DNA被识别后，Au@PtNPs催化TMB的氧化反应，生成氧化TMB（oxTMB），同时产生可见的颜色变化和近红外光热响应。这种双模信号的产生使得检测结果更加直观和可靠。

此外，磁珠辅助分离技术的引入，进一步降低了非特异性背景信号，提高了检测的准确性。磁珠能够快速分离目标DNA与非特异性成分，从而减少干扰，提高检测的信噪比。这种技术的应用使得CP-CasAuPt平台在复杂临床样本中表现出良好的性能，为多模分子诊断提供了一种通用策略。

在实验设计中，研究人员使用了多种材料和试剂，包括氯铂酸钾、TMB、氯金酸、抗坏血酸和柠檬酸钠等。这些材料和试剂由不同的供应商提供，确保了实验的准确性和可重复性。此外，实验中还使用了LbCas12a、等温扩增缓冲液和Bst 2.0 DNA聚合酶等，这些试剂的来源和质量控制也是实验成功的关键因素。

本文的结论表明，CP-CasAuPt平台是一种磁控双模生物传感技术，能够有效整合CRISPR/Cas12a的识别能力与Au@Pt纳米酶的催化作用，实现对病原体的快速、准确检测。这种平台不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还通过双模信号的交叉验证，减少了检测中的误差。同时，磁珠辅助分离技术的引入，进一步提高了检测的准确性和稳定性，使其在资源有限的环境中具有广泛的应用前景。

综上所述，本文提出了一种基于CRISPR/Cas12a和Au@Pt纳米酶的双模生物传感平台，为新生儿感染的快速诊断提供了一种新的解决方案。该平台结合了多种先进的技术，如磁珠辅助分离、颜色和光热双模信号读取，以及纳米酶的催化作用，实现了高灵敏度、高特异性、低背景干扰和稳定性的检测。这些优势使得CP-CasAuPt平台在资源有限的地区具有重要的应用价值，为下一代点对点检测技术的发展提供了新的思路。