THU与ALK-5抑制剂EW-7197联合应用通过抑制脂肪生成和纤维化展现显著的抗MASH活性

《Scientific Reports》：Combination of THU/ALK-5i exhibits profound anti-MASH activity through suppression of lipogenesis and fibrogenesis

　　本研究针对代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(MASH)这一缺乏有效治疗手段的进展性肝病，探讨了四氢姜黄素(THU)与ALK-5抑制剂EW-7197联合治疗的潜力。研究人员通过体外细胞模型(TGF-β刺激的肝细胞和星状细胞)和体内MCD饮食诱导的小鼠MASH模型，证实该联合疗法能协同改善肝纤维化、脂肪变性和炎症反应，其机制涉及抑制TGF-β/Smad通路、调节AMPK/SREBP-1c脂生成通路及NF-κB炎症通路。这项概念验证研究为开发多靶点MASH治疗策略提供了新思路。

　　

在当今社会，代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MAFLD)已成为慢性肝病的主要病因，其全球患病率持续上升。这种疾病谱包括从单纯性脂肪变性到脂肪性肝炎(MASH)，进而发展为肝纤维化，最终可能导致肝硬化。MASH是一种进展性肝病，以肝细胞脂肪变性、炎症和肝细胞损伤为特征，其中纤维化主要由转化生长因子-β(TGF-β)介导。尽管生活方式干预是基础治疗，但由于MASH的多方面病理生理学特点，开发有效的药物治疗仍然充满挑战。

目前MASH治疗面临的主要问题包括：单一靶点药物往往难以全面改善疾病的多个方面；现有药物治疗常涉及多药联用，可能导致副作用和患者依从性差。理想的MASH疗法应具备多重作用，包括降脂、抗炎和抗纤维化效果。因此，开发能够同时针对多个病理环节的治疗策略具有重要意义。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，研究人员评估了四氢姜黄素(THU，姜黄素的主要代谢物)与EW-7197(一种ALK-5抑制剂)联合使用对MASH进展的治疗潜力。THU比姜黄素具有更优越的药代动力学特性，而EW-7197则能有效阻断TGF-β介导的促纤维化效应。研究人员假设这种联合疗法能够通过减轻炎症、减少脂肪变性和抑制纤维生成来阻止MASH进展。

为验证这一假设，研究团队设计了体外和体内实验。在体外实验中，研究人员用TGF-β处理肝细胞(AML-12)和星状细胞(LX-2)，并分别给予THU(1μM)、EW-7197(0.5μM)或其联合处理。在体内实验中，喂食蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食六周的雄性C57BL/6J小鼠口服接受EW-7197(20 mg/kg)和THU(100 mg/kg)治疗。

研究使用的主要关键技术方法包括：细胞培养模型(AML-12肝细胞和LX-2星状细胞)、免疫荧光检测、BODIPY染色分析脂质积累、MCD饮食诱导的小鼠MASH模型、组织学染色(H&E和Masson三色染色)及评分系统(NAFLD活动度评分NAS)、蛋白质印迹分析关键信号通路蛋白表达。

EW-7197缓解肝细胞纤维化

研究人员首先在人类肝星状细胞LX-2中评估了化合物的抗纤维化作用。TGF-β(5 ng/mL)刺激通过激活经典TGF-β/Smad2/3通路上调了细胞外基质(ECM)蛋白表达，包括α-SMA、Col1A和CTGF。THU单药治疗对TGF-β刺激的LX-2细胞中ECM蛋白表达没有产生统计学显著抑制，而EW-7197单独或与THU联合处理显著降低了ECM蛋白表达，尤其是α-SMA和Col1A。在治疗组中，THU+EW-7197联合治疗获得了最显著的抗纤维化效果。

THU和EW-7197的联合治疗增强了对MCD诱导的MASH小鼠的抗纤维化作用

与体外模型一致，MCD喂养的MASH小鼠模型也反映了这些发现。EW-7197和THU+EW-7197联合治疗在MASH小鼠中表现出强大的抗纤维化作用。这些治疗通过经典p-Smad2/3通路抑制了ECM蛋白水平。虽然THU也表现出降低ECM蛋白水平的趋势，但对某些研究的蛋白(如CTGF)而言，这些降低没有统计学意义。联合治疗方法导致了α-SMA表达的显著降低，这在各种细胞外基质蛋白的背景下特别明显。

THU改善MASH模型中的肝损伤

MCD喂养诱导了明显的MASH表型，其特征是广泛的肝脂滴积累、肝TG含量增加、ECM沉积增强以及血清AST和ALT水平升高。THU治疗显著减轻了肝脂肪变性，表现为脂滴面积减少、肝TG降低和脂肪变性评分降低。然而，其抗纤维化作用较为有限，未达到统计学显著性。相比之下，EW-7197治疗显著减轻了ECM沉积和纤维化面积，而对脂肪变性的影响较小。值得注意的是，THU和EW-7197的联合治疗产生了最显著的组织学改善，同时减少了脂肪变性、小叶炎症和纤维化。这些效应反映在相比任一单药治疗显著更低的NAS评分上。

EW-7197缓解体外肝细胞损伤，但伴有轻度脂质代谢紊乱

与在肝星状细胞中进行的实验一致，研究发现EW-7197有效抑制肝细胞中的促纤维化标志物表达：p-Smad3、Col1A、α-SMA和CTGF，且比THU更有效。此外，联合治疗组表现出最显著的抗纤维化效果。

有趣的是，在TGF-β攻击的AML-12模型中，TGF-β诱导了形态学变化，将这种肝细胞的形状转变为成纤维细胞样形态。然而，EW-7197治疗逆转了这些形态学改变。对每个细胞脂滴数量和BODIPY染色强度的定量评估显示，EW-7197治疗后TGF-β攻击的AML-12细胞中脂质积累显著增加，表明对脂质积累产生了不利影响。这通过脂源性基因Srebp-1c和Fasn的表达增加得到进一步证实。THU减轻了EW-7197在肝细胞中的不良影响。THU和EW-7197的联合处理导致与EW-7197单药治疗相比，脂滴和脂源性基因表达均减少。

THU防止p-AMPK下调并减少脂质积累

为了研究THU改善脂质代谢的潜力，用棕榈酸(PA)攻击AML-12细胞。PA是各种细胞类型中公认的脂毒性诱导剂。与其他研究小组的发现一致，PA诱导了AML-12细胞的细胞应激并增强了脂质积累，这通过显微镜和BODIPY染色得到证实。在PA处理组中观察到每个细胞的脂滴、每个细胞的脂滴面积和每个细胞的BODIPY染色强度显著增加。这些信号在治疗后减弱，最明显的是THU，并且在联合治疗下减弱最为显著。虽然AMPK磷酸化降低，但Srebp-1c和Fasn上调。THU治疗防止了p-AMPK的下调，从而抑制了Srebp-1c和Fasn的过表达，这些是脂肪生成的关键参与者。

THU显示抗炎作用

据报道，PA通过增加NF-κB的磷酸化引发炎症反应。与此知识一致，我们的实验显示，在PA暴露的AML-12细胞中，p-NF-κB水平及其下游靶点IL-1β和MCP-1升高。THU治疗抑制了p-NF-κB及其下游基因，从而减轻了PA诱导的细胞炎症。这些发现表明THU具有抗炎作用。尽管EW-7197倾向于保护细胞免受PA诱导的炎症，但降低幅度在所有下游靶点中并不一致。从MCD喂养小鼠模型获得的体内结果反映了体外观察结果。EW-7197单独治疗通过降低p-NF-κB水平显示出抗炎趋势。然而，与疾病对照组相比，其一些下游靶点未能达到统计学显著差异，特别是MCP-1。THU表现出比EW-7197更强大的抗炎作用。总之，联合治疗与单药治疗相比表现出更优的抗炎活性。

THU改善氧化还原状态并显示抗凋亡作用

研究结果显示，在PA攻击的AML-12细胞中，负责产生活性氧(ROS)的酶NADPH氧化酶4(NOX4)的表达增加。值得注意的是，用THU单独或联合治疗有效逆转了这些效应。此外，PA暴露增加了Caspase-3(细胞凋亡的关键执行者)的表达和促凋亡的Bax/Bcl-2比率。有趣的是，THU和联合治疗均显著降低了Caspase-3的表达和Bax/Bcl-2比率，表明细胞凋亡减少。虽然EW-7197单独使用倾向于减少细胞凋亡，但其效果不具有统计学显著性。

在MASH的MCD小鼠模型中，NOX4表达上调，而对抗ROS的超氧化物歧化酶2(SOD2)下调。MCD饮食诱导的这些表型可以通过给予THU或THU与EW-7197的联合用药来纠正。此外，在MCD喂养小鼠中升高的Caspase-3和Bax/Bcl2比率，在THU和联合治疗组中降低。这些结果共同表明，THU改善了细胞氧化还原状态，从而减少了细胞应激和凋亡。

本研究证明，THU和EW-7197的联合治疗在MCD诱导的MASH模型中提供了互补的益处。THU主要减轻脂肪变性和脂质积累，而EW-7197通过减少ECM沉积靶向纤维生成通路。联合方案协同减少了脂肪变性、炎症和纤维化，导致NAS评分最显著降低。这些发现强调了在MASH中多管齐下治疗策略的价值，其中同时靶向脂质代谢和纤维生成可能比单通路干预获得更优的结果。

该研究提供了概念验证证据，表明THU和EW-7197的组合可以同时靶向MASH中的脂肪变性、炎症和纤维化。THU主要改善了脂质积累和炎症应激，而EW-7197抑制了纤维生成通路，联合用药在MCD喂养的小鼠模型中产生了最显著的组织学改善。然而，作者也指出需要在代谢相关模型中进行验证、药代动力学分析以及与临床基准进行比较，以证实其转化潜力。

这项研究的重要意义在于它为开发针对MASH的多靶点治疗策略提供了新的思路。通过将具有脂质调节和抗炎特性的天然化合物衍生物(THU)与特异性抗纤维化药物(EW-7197)相结合，研究人员展示了一种协同治疗方法，能够更全面地应对MASH的复杂病理生理学。这种联合策略可能为目前缺乏有效药物治疗的MASH患者提供新的希望，特别是考虑到THU作为天然产物衍生物可能具有更好的安全性和耐受性。