利用CRISPR相关转座酶在体内对共生细菌进行宏基因组编辑

《SCIENCE》：Metagenomic editing of commensal bacteria in vivo using CRISPR-associated transposases

　　MetaEdit是一种新型微生物组编辑技术，利用CRISPR相关转座酶通过接合传递大片段DNA，在活体动物肠道内精准编辑目标菌群，包括难以培养的 segmented filamentous bacteria。该技术通过设计引导RNA实现物种特异性整合，并借助饮食调控（如菊粉）实现编辑菌群的动态扩增与逆转，为微生物组功能研究和治疗策略提供新工具。

　　

编辑总结

肠道细菌对健康起着至关重要的作用，但科学家们一直缺乏精确的工具来基因改造体内特定的微生物。Gelinger等人开发了MetaEdit技术，该技术利用移动的CRISPR相关转座酶直接修改活体动物体内肠道细菌的基因组（参见Maire和Bikard的观点文章）。他们将新的代谢特性插入常见细菌中，通过饮食来控制这些微生物，并成功编辑了难以培养的物种。MetaEdit展示了如何编程和选择性地富集特定细菌功能，为微生物组研究和针对个别细菌物种的治疗策略打开了新的可能性。——Di Jiang

结构化摘要

引言

宏基因组测序允许在不进行培养的情况下分析肠道微生物组，揭示影响宿主营养、免疫和健康的多样化共生细菌。然而，目前很少有类似的方法可以直接在自然肠道环境中操纵这些微生物的基因组。传统的细菌基因组编辑工具，如噬菌体、随机转座酶和CRISPR-Cas核酸酶，要么编程能力有限，要么特异性低，要么只能产生微小的基因变化。一种直接、可调且在体内能够精确持久地生成目标物种基因组编辑的方法，将加速对肠道微生物群的功能解析，并进一步释放其治疗潜力。

原理

基于我们发现的能够将数千碱基大小的DNA载荷稳定整合到特定位点的CRISPR相关转座酶（CASTs），我们提出了宏基因组编辑（MetaEdit）平台。该平台通过微生物组传递CASTs，将大段DNA载荷稳定整合到目标细菌的基因组中。一种非移植型的大肠杆菌供体通过接合作用将携带所需载荷的移动CAST质粒广泛传播到革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中。在受体细胞中，可编程的引导RNA介导载荷的精确整合，从而实现具有菌株级特异性的稳定基因组编辑。供体、CAST机制和引导RNA共同作用，使MetaEdit能够在数吉碱基的宏基因组序列空间内直接改变目标物种，包括那些在肠道中存在但难以在实验室中培养的重要共生细菌。

结果

首先，MetaEdit经过系统优化，实现了在多种人类拟杆菌科（Bacteroidaceae）分离株中高效（>50%）的基因组整合，并且脱靶现象极少。利用计算机设计的引导RNA，我们在定植了特定六种细菌群落的小鼠中展示了物种特异性的编辑。在具有复杂自然菌群的小鼠中，我们以高特异性（>99%的靶向率）用抗生素抗性标记物标记了天然存在的鼠拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron，简称Bt），从而能够从粪便中选择性地分离出这种细菌。随后，我们在Bt中引入了一个7.5 kb的代谢路径载荷，使其具备了代谢菊粉纤维的能力。几周后，菊粉补充使编辑后的Bt细胞数量增加了30到40倍。停止提供菊粉后，由于与天然细菌的竞争，修饰后的Bt数量迅速减少，这表明了饮食对微生物组编辑的控制作用及其可逆性。最后，MetaEdit首次被用于分段丝状细菌（SFB）的体内基因工程改造，这是一种通常难以培养的关键免疫调节微生物。将荧光报告基因整合到SFB基因组中后，可以可视化被编辑的细菌丝状结构，证明了这种定植于小肠的共生细菌的直接改造。

结论

MetaEdit为在细菌的天然胃肠道栖息地中进行精确和持久的基因组编辑提供了一种新方法。通过引入正交的代谢途径或报告基因，这种策略能够实现可逆的、受饮食影响的工程菌株控制，并允许对无法培养的物种进行功能扰动。除了揭示微生物群与肠道之间的生物学关系外，MetaEdit还可以应用于基于微生物组的治疗或中和病原体。未来的工作可以提高MetaEdit的传递效率，并利用新发现的RNA引导重组酶，同时将其应用扩展到来自不同生态系统的其他微生物组中。

摘要

尽管宏基因组测序揭示了哺乳动物肠道中丰富的微生物多样性，但目前用于基因改造微生物组中特定物种的方法非常有限。在这里，我们介绍了宏基因组编辑（MetaEdit）这一平台技术，它利用优化的CRISPR相关转座酶，通过广泛接合的载体将它们传递到小鼠和人类的肠道细菌中，以单核苷酸分辨率直接修改多种天然共生细菌的基因组。通过MetaEdit，我们实现了对天然鼠拟杆菌的体内基因捕获，通过整合代谢载荷使其生长受饮食中的菊粉调节。我们还展示了分段丝状细菌的体内编辑，这种微生物难以在实验室中培养。总体而言，这项工作为在数吉碱基的宏基因组范围内精确操控单个细菌提供了范例。