噬菌体感染产孢梭菌（Clostridium sporogenes）

《Microbiology Resource Announcements》：Phages infecting Clostridium sporogenes

　　Clostridium sporogenes噬菌体基因组测序及分类研究。2024年9月20日从美国利弗莫尔水再生处理厂污水样本中分离出30种新型噬菌体，经测序和Pharokka注释发现其具有高GC含量（35.5-36.0%）、83-86个蛋白基因，形成三个近缘物种簇。基因组通过Illumina MiSeq测序，使用SPAdes组装和VIRIDIC分类系统确认，未发现tRNA基因，与NC_019924.1存在高度相似性（91.6-100% BLASTN匹配）。结果为控制该产气荚膜梭菌提供了新资源。

　　这项研究聚焦于一种名为 *Clostridium sporogenes* 的厌氧菌，该菌广泛存在于环境中，常与食品腐败有关。同时，它也是一种常见的肠道共生菌，对人体无害。此外，*C. sporogenes* 还被用作 *Clostridium botulinum*（肉毒杆菌）的非毒素产生型模型生物，这使得它在研究和应用上具有重要意义。研究人员在本研究中成功分离并鉴定了30种能够感染 *C. sporogenes* 的噬菌体，并对其基因组进行了测序和注释。这些噬菌体为开发用于控制 *C. sporogenes* 及其相关物种的工具提供了宝贵的资源。

噬菌体是一种病毒，它们能够感染细菌，并在宿主细胞内复制，最终导致宿主细胞裂解。由于噬菌体具有高度的宿主特异性，它们在生物控制领域展现出巨大的潜力。特别是在食品安全和微生物生态学研究中，噬菌体可用于减少有害细菌的生长，而不会对环境或其他微生物造成不必要的影响。本研究中发现的噬菌体，具有独特的基因组结构和功能，为深入理解 *C. sporogenes* 的生态角色以及探索其在生物控制中的应用提供了新的视角。

研究过程始于从加利福尼亚州利弗莫尔市的利弗莫尔污水处理厂（Livermore Water Reclamation Plant）采集的多个污水样本。这些样本于2024年9月20日获得，并通过过滤（孔径为0.45微米）和富集（使用 *C. sporogenes* ATCC 15579菌株）的方式进行处理。实验条件严格控制在厌氧环境中，温度维持在37°C，并使用Don Whitley公司的A35型厌氧培养箱，提供5%的氢气以维持厌氧状态。培养基采用强化梭菌培养基（Reinforced Clostridial Medium），由西格玛奥德里奇公司提供。通过这些条件，研究人员成功培养出大量噬菌体，并观察到不同形态的噬菌斑。

噬菌斑的形成是噬菌体感染宿主细菌后，导致细菌细胞裂解并在培养基上形成可见的透明区域。研究中发现，大多数噬菌斑的大小适中，中心清晰，边缘模糊且不规则，但有一个例外，即CS19噬菌体形成的噬菌斑非常大且边缘模糊。这表明CS19噬菌体可能具有不同的感染机制或宿主适应性。为了确保获得高质量的噬菌体基因组，研究人员对43个噬菌斑进行了三次纯化，并从高滴度的噬菌体悬液中提取了基因组DNA。这些DNA样本随后被用于构建测序文库，并使用Illumina公司的MiSeq V3 150-cycle kit进行双端测序。

测序结果揭示了42个噬菌体的基因组信息，其中30个基因组被认为是独特的。每个基因组都呈现出相似的结构特征，例如长度在4,433到48,556碱基对之间，覆盖度较高，GC含量在35.5%到36.0%之间。基因数量在81到86个之间，显示出一定的多样性。研究人员利用SPAdes v3.15.5软件进行基因组组装，并通过手动修剪约55个碱基对的末端重复序列来完成基因组的环化处理。这一过程确保了基因组的完整性，并通过ReadStepper工具验证了其环形结构。

在基因组注释方面，研究人员使用Pharokka v1.7.5软件进行分析，并设置了特定的参数（-g prodigal --dnapler）。注释结果显示，这些噬菌体基因组中没有tRNA基因，这表明它们的基因组结构相对简单，可能不包含复杂的调控元件。此外，基因注释中包含大量与尾部结构相关的基因，但缺乏整合酶或调控蛋白基因，这进一步支持了它们属于一种具有裂解特性的尾部噬菌体（Caudoviricetes）。这一分类表明这些噬菌体在感染宿主后，会直接裂解细菌细胞，而不是将其整合到宿主的基因组中。

为了进一步确定这些噬菌体的分类地位，研究人员将其基因组序列与ICTV（国际病毒分类委员会）的参考数据进行比对。结果显示，这些新发现的噬菌体序列与已知的 *C. sporogenes* 噬菌体phi8074-B1具有高度相似性，但在与其他病毒或细菌病毒的参考序列比对时，未能找到匹配项。这一发现表明，这些噬菌体可能属于一个新的分类单元，或者它们的基因组结构与已知的病毒有所不同。为了更准确地分类这些噬菌体，研究人员将它们的基因组序列提交至VIRIDIC数据库，该数据库专门用于病毒分类和系统发育分析。

VIRIDIC数据库的分析结果显示，这些新噬菌体的基因组序列被归类为一个单一的属群（genus cluster）和四个物种群（species clusters）。其中，一个物种群仅包含phi8074-B1。这一分类结果为后续研究提供了重要的参考，有助于理解这些噬菌体在生态系统中的作用以及它们与宿主细菌之间的相互关系。同时，这也为开发针对 *C. sporogenes* 的噬菌体疗法提供了理论基础。

在基因组结构分析方面，研究人员利用MAFFT v7.526软件对所有噬菌体的基因组序列进行了比对，并生成了一个包含54,380列的全基因组比对矩阵。基于这一比对矩阵，他们使用RAxML-NG v. 1.2.2软件构建了系统发育树，以展示这些噬菌体之间的遗传关系。系统发育树显示，这些噬菌体形成了几个紧密的分支，其中一些分支的系统发育支持值较高，而另一些则相对较低。这一结果表明，尽管这些噬菌体在基因组结构上具有一定的相似性，但它们之间仍存在一定的遗传差异。

此外，研究人员还通过BLASTP分析对噬菌体蛋白质进行了聚类，并根据蛋白质的分布情况进一步分析了它们的基因组特征。蛋白质聚类结果显示，这些噬菌体的蛋白质序列在某些区域表现出高度的相似性，而在其他区域则较为分散。这种蛋白质分布模式有助于识别噬菌体的关键功能基因，例如与宿主识别、感染过程和裂解机制相关的基因。通过这些分析，研究人员能够更全面地了解噬菌体的生物学特性及其在宿主细菌中的作用机制。

在研究方法上，研究人员采用了标准化的流程，以确保实验结果的可靠性和可重复性。例如，所有软件均使用默认参数进行运行，除非另有说明。这种做法有助于减少人为干预对结果的影响，并提高数据的客观性。同时，研究中使用的测序技术和基因组分析方法均为当前主流技术，具有较高的准确性和分辨率，能够有效捕捉噬菌体的基因组特征。

本研究的成果不仅丰富了对 *C. sporogenes* 噬菌体的认知，也为进一步研究这些噬菌体的生物学功能和应用潜力提供了基础。例如，研究人员可以利用这些噬菌体开发针对 *C. sporogenes* 的噬菌体疗法，以减少其在食品或环境中可能带来的负面影响。此外，这些噬菌体还可以作为研究细菌-噬菌体相互作用的模型，帮助科学家更好地理解细菌的抗噬菌体机制以及噬菌体如何适应不同的宿主环境。

在应用层面，这些噬菌体可能被用于食品工业中，以控制 *C. sporogenes* 的生长，从而防止食品腐败。此外，它们也可能被用于生物技术领域，例如在基因工程或合成生物学中，作为工具病毒用于特定的基因操作或生物控制策略。然而，这些应用仍需进一步研究，以确保噬菌体的安全性和有效性。

本研究还强调了环境样本在噬菌体研究中的重要性。污水处理厂等环境中可能富含多种噬菌体，这些噬菌体不仅可能感染特定的细菌，还可能在生态系统中发挥重要作用。因此，对这些噬菌体的系统性研究有助于揭示其在自然环境中的分布、功能和生态角色。此外，这一研究也为其他厌氧菌的噬菌体研究提供了方法上的参考，展示了如何通过环境采样和基因组分析来发现和鉴定新的噬菌体。

总的来说，这项研究通过系统性采集和分析环境样本，成功分离并鉴定了30种新的 *C. sporogenes* 噬菌体。这些噬菌体的基因组特征表明它们属于一个独特的分类单元，具有较高的遗传相似性，但也表现出一定的多样性。这一发现不仅有助于深入理解 *C. sporogenes* 的生态角色，还为开发新的噬菌体控制工具提供了重要的资源。未来的研究可以进一步探索这些噬菌体的生物学功能、感染机制以及潜在的应用价值，以期在食品安全、微生物生态学和生物技术等领域取得更多的突破。