一种用于确定小鼠大脑中活跃神经元和神经网络的框架揭示了大脑活动在一天中的变化情况

《PLOS Biology》：A framework to determine active neurons and networks within the mouse brain reveals how brain activity changes over the course of the day

　　小鼠大脑活动节律与网络动态研究：通过c-Fos标记结合空间转录组数据和主动连接性分析，揭示层5神经元在活跃末期显著激活，全脑兴奋抑制平衡在丘脑动态变化，网络枢纽从丘脑后下丘脑核转移至皮层区域，特别是默认模式网络（DMN）在日周期末期作用增强。

　　脑活动是一个复杂而动态的过程，其变化不仅受到外部环境的影响，还与内部生理机制密切相关。研究表明，即使是在相同的神经元和物理连接下，小鼠的脑活动也会随着一天的时间推移而发生显著变化。这种变化可能涉及神经元的活跃状态、神经网络的组织形式以及神经元之间的信息传递方式。为了更深入地理解这些变化，科学家们开发了一种结合实验和计算的分析方法，用于确定在一天的不同时间段哪些神经元和网络最为活跃。

这项研究的核心在于利用一种名为TRAP2的系统，该系统能够根据c-Fos基因的表达情况标记活跃的神经元。c-Fos是一种在神经元激活后迅速表达的即时早期基因，因此其表达可以作为神经元活跃的标志。通过将TRAP2系统与另一种表达tdTomato的基因型小鼠（Ai14）进行杂交，研究人员能够在特定的时间窗口内标记出活跃的神经元。随后，利用组织透明化技术（如CUBIC）和光片显微镜（mesoSPIM），科学家们获得了小鼠脑组织的三维图像，并利用机器学习算法对这些图像中的神经元进行分割和重建。最终，这些数据被对齐到Allen Brain Atlas的公共坐标框架（ABA-CCFv3），从而可以与已有的空间转录组数据进行整合。

空间转录组数据提供了小鼠脑内细胞的分子特征，如释放的神经递质类型。通过将标记的神经元与这些数据进行匹配，研究人员能够确定这些神经元的分子身份。例如，通过计算每个神经元与参考数据集中相同区域的其他神经元之间的距离，可以找到最接近的“双胞胎”神经元，从而推断其分子特性。这种匹配方法特别适用于那些神经元类型较为明确的脑区，如丘脑或下丘脑，而在神经元类型混合的区域（如皮层的第2/3层）可能会产生一定的误差。

研究发现，小鼠脑中不同区域和层的神经元活跃情况存在显著差异。在一天的不同时间段，皮层中的活跃神经元数量和分布发生了变化。例如，在ZT0-4（即暗期开始时）和ZT20-24（即暗期结束时）这两个时间点，皮层的活跃神经元数量明显增加，尤其是在第5层神经元中。这一现象可能与皮层在这些时间段内的信息处理需求增加有关，因为第5层神经元在神经网络的整合和长距离信息传递中起着关键作用。此外，研究还发现，小鼠在不同时间段内的兴奋性（谷氨酸能）神经元和抑制性（GABA能）神经元的比例发生了变化，尤其是在丘脑区域，这种变化可能与睡眠和觉醒状态的转换相关。

为了进一步分析这些活跃神经元之间的网络结构，研究人员引入了一种新的概念——“活跃连接”（active connectivity）。活跃连接不仅考虑了不同脑区之间的物理连接强度，还结合了这些脑区中活跃神经元的数量。通过这种方法，可以更准确地评估神经网络在不同时间段内的活跃程度和组织结构。研究结果显示，活跃连接在ZT20-24（即暗期结束时）的强度最高，这可能反映了神经网络在这一时间点的整合程度增加。然而，网络的模块化程度却显著降低，表明不同脑区之间的通信变得更加广泛和复杂。

在分析网络结构时，研究人员还关注了网络中的“枢纽”（hubs）——那些在神经网络中起关键作用的脑区。通过计算这些枢纽的“介数中心性”（betweenness centrality），研究人员发现，随着一天的推移，枢纽的分布发生了显著变化。在ZT12-16（即暗期开始时），枢纽主要集中在下丘脑后部（PH）等次皮层区域，而在ZT20-24（即暗期结束时），枢纽则更多地出现在皮层的默认模式网络（DMN）区域。这种变化可能与大脑在不同时间段的功能需求有关，例如，在暗期结束时，DMN可能在调节休息和睡眠状态中发挥重要作用。

研究还揭示了不同时间段内神经元类型的分布变化。例如，在ZT20-24，兴奋性神经元的比例显著增加，而抑制性神经元的比例则相对减少。这种兴奋性/抑制性（E/I）比例的变化可能与神经元之间的相互作用增强有关，尤其是在需要大量信息处理和整合的脑区。然而，这种变化并非在所有脑区中都一致，某些区域（如前扣带回皮层和前岛叶皮层）则保持相对稳定的E/I比例，这可能与其在大脑中的特殊功能有关。

研究团队还通过比较活跃连接与功能性连接（functional connectivity）的关系，探讨了大脑网络的动态特性。功能性连接通常基于功能磁共振成像（fMRI）等技术，用于测量不同脑区之间的活动相关性，而活跃连接则基于物理连接和活跃神经元的分布。这种对比表明，活跃连接能够更准确地反映大脑网络的结构变化，尤其是在较长的时间尺度上。相比之下，功能性连接更适用于研究短时间内（几秒到几分钟）的动态交互。因此，活跃连接为理解大脑在不同时间段内的网络组织和功能状态提供了一种新的视角。

研究中还提到，虽然当前的实验设计主要集中在一天中的四个时间段，但该方法可以扩展到其他条件，如神经退行性疾病、行为干预、睡眠剥夺等。这为未来的神经科学研究提供了重要的工具和框架。此外，研究团队还指出了未来研究的方向，包括利用更高分辨率的空间转录组数据、整合更多的神经元类型信息以及进一步优化实验流程，以提高数据的准确性和全面性。

总之，这项研究通过整合多种先进的技术和方法，揭示了小鼠脑活动随时间变化的动态模式。它不仅提供了关于活跃神经元分布和分子特性的详细信息，还分析了这些神经元之间的网络结构和功能变化。这些发现对于理解大脑如何在不同时间段内适应环境变化、调节行为和维持生理功能具有重要意义。未来，随着更多数据的积累和技术的发展，这种方法有望进一步推动神经科学领域的研究进展。