可用于棉铃虫核型多角体病毒（BmNPV）和家蚕鼻孢子虫（Nosema bombycis）的野外可部署CRISPR-Dx技术：无需DNA提取的“一锅法”RPA-Cas12a及Cas12a/Cas13a双基因检测方法，支持使用手持设备进行操作

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Field-deployable CRISPR-Dx for BmNPV and Nosema bombycis: DNA-extraction-free one-pot RPA-Cas12a and Cas12a/Cas13a dual-gene assays with handheld devices

　　本研究开发了一种无需DNA提取的一体化RPA-CRISPR/Cas12a检测系统（DEORC）和双基因检测方法，可同时快速检测家蚕核型多角体病毒（BmNPV）和微粒子虫（N. bombycis），适用于现场诊断。

　　在丝虫病的防控中，快速、准确、敏感且便捷的病原体诊断技术至关重要。目前，尽管基于CRISPR的核酸检测系统在田间检测中展现出巨大的潜力，但其实际应用仍受到复杂操作流程和试剂储存条件的限制。为了克服这些障碍并提升现场检测的适用性，我们开发了一种无需DNA提取的一锅式RPA-CRISPR/Cas12a（DEORC）系统，以及一种用于同时检测丝茧核型多角体病毒（BmNPV）和丝虫微孢子虫（N. bombycis）的双基因检测方法。该系统结合了便携式设备，能够在70分钟内完成从采样到可视化读数的全过程，无需复杂的设备。此外，我们通过使用1 M betaine作为冻干保护剂，对Cas12a检测试剂进行了冻干处理，使其在4°C下可稳定保存一个月，从而便于短期冷藏运输和现场储存。双基因检测方法能够检测10^3拷贝/μL的双参考质粒，并在单个反应管中同时检测BmNPV和N. bombycis，从中肠样本中检测到的时间为48小时后；当结合无提取技术时，可在血液样本中检测到两种病原体，时间为72小时后。这些技术进步为现场蚕业疾病管理提供了敏感且便携的工具，相较于传统的两步单基因检测方法和常规实验室方法，具有更快、更实用的操作流程。

丝虫（Bombyx mori）作为丝绸产业的重要组成部分，具有显著的经济价值和文化意义，尤其是在中国。然而，由于高密度养殖方式和缺乏有效的疾病防控策略，丝虫容易受到由细菌、真菌、病毒和微孢子虫等引起的传染病的影响。其中，BmNPV和N. bombycis是最具代表性的两种病原体，它们能够引发严重的疾病，对蚕业的可持续发展构成重大威胁。传统的检测方法主要依赖于显微镜和染色技术，通过观察病原体的形态特征和特定的染色特性来识别它们。即使在今天，由路易斯·巴斯德（Louis Pasteur）开发的母蚕显微镜法（FMM）结合新孵化F1幼虫的验证，仍然是识别N. bombycis的主要方法之一。然而，这些方法存在灵敏度低、特异性不足、操作繁琐以及依赖专业技术人员等问题，难以满足现代蚕业的需求。

定量聚合酶链式反应（qPCR）因其高灵敏度、高特异性和良好的重复性，已成为检测病原微生物的黄金标准。qPCR技术已被纳入蚕业标准中，用于检测N. bombycis（NY/T 3677–2020, SN/T 4292–2015）、BmNPV（NY/T 3421–2019）和BmCPV（NY/T 3166–2017）等病原体（He et al., 2025）。然而，由于地域限制、专业技术人员短缺以及对专用设备的依赖，qPCR技术仍然局限于设备完善的实验室，检测过程通常需要24小时才能完成（Zhang et al., 2021）。

近年来，CRISPR/Cas系统因其成本效益、设计简便以及快速、特异的识别能力，逐渐成为一种新型的基因编辑工具，受到了广泛关注（Gootenberg et al., 2018）。当与高灵敏度的等温核酸扩增技术如重组酶聚合酶扩增（RPA）相结合时，CRISPR/Cas系统能够实现快速的核酸扩增和精确的切割，为现场快速诊断提供了一种有力的替代方案（Gootenberg et al., 2018; Ding et al., 2020）。我们的研究团队一直在致力于开发基于CRISPR/Cas的检测方法，以提供一种新型的现场诊断工具。在之前的实验中，我们基于CRISPR/Cas12a和Cas13a系统的特性，结合RPA技术，开发了用于检测BmNPV和N. bombycis的核酸检测方法，实现了1–2拷贝/μL的检测限，并在45分钟内完成快速、可视化的识别（Zhao et al., 2023; Wu et al., 2024; Zhou et al., 2024）。现有的RPA-CRISPR/Cas病原体检测系统包括三个基本步骤：核酸提取、等温核酸扩增和CRISPR反应。未来的发展方向是将这些步骤整合为一个简化的流程，以缩短处理时间，实现即时诊断。然而，仍然存在一些挑战：（1）依赖传统的、昂贵且耗时的核酸提取方法；（2）RPA和CRISPR反应分别在不同的反应管中进行，延长了处理时间并增加了交叉污染的风险；（3）系统无法在同一反应管中同时检测多种病原体；（4）CRISPR试剂需要冷链运输和储存，限制了其在野外环境中的应用。

为了解决上述问题，我们设计了一种无需DNA提取的一锅式RPA-CRISPR/Cas12a检测系统，以提高检测效率和便携性。同时，我们还开发了一种双基因检测系统，通过设计基于Cas12a和Cas13a的旁侧切割活性的荧光探针，如FAM-BHQ1单链RNA（FB-ssRNA）和HEX-BHQ1单链DNA（HB-ssDNA），实现了在同一反应管中通过不同的荧光信号同时检测BmNPV和N. bombycis。此外，我们还研究了真空冷冻干燥技术结合冻干保护剂对CRISPR/Cas12a试剂的稳定性和有效性。我们相信，这些便携式的检测方法能够为现场蚕业疾病管理提供一种强大、用户友好的解决方案，从而提升早期诊断和控制能力，支持资源有限环境下的可持续生产。

在本研究中，我们使用的健康丝虫卵（4008株系）以及病原体BmNPV和N. bombycis均来源于中国农业科学院蚕业研究所的丝虫病理学实验室（镇江，中国）。RPA引物由上海桑尼生物科技公司合成，而HB-ssDNA、FB-ssRNA和FB-ssDNA报告探针则由湖州华美生物科技公司合成。RPA检测试剂盒（DNA热稳定快速扩增试剂盒）购自Amp公司。我们对无DNA提取扩增方法进行了优化，研究了孵育温度和时间的影响（图1A和1B）。结果表明，随着温度的升高，BmNPV核酸的释放显著增加，突显了NCRB裂解效率的强温度依赖性。在50°C和75°C条件下，延长孵育时间从10分钟到15分钟对裂解效率没有显著影响。相比之下，在95°C条件下，延长孵育时间显著提高了96小时感染后样本的裂解效率，而对于72小时感染后的样本则没有明显变化。

本研究旨在开发一种快速、适用于现场的BmNPV和N. bombycis诊断工具，以克服传统和实验室方法的不足。其意义在于通过提供高灵敏度、低成本且便携的检测系统，推动蚕业的发展，提高疾病管理效率，并支持资源有限环境下的可持续生产。我们开发了一种无需DNA提取的一锅式RPA/CRISPR-Cas12a检测方法，该方法在提高检测效率的同时，也减少了对复杂设备的依赖。此外，我们还探讨了冻干CRISPR/Cas12a试剂的有效性和稳定性，通过使用1 M betaine作为冻干保护剂，使得试剂在4°C条件下可稳定保存一个月，从而便于短期冷藏运输和现场储存。这些技术进步不仅提高了检测的便捷性和可及性，也为蚕业提供了更有效的病原体监测手段，有助于实现早期诊断和及时干预，从而减少疾病对蚕业生产的负面影响。