综述：用于提高生物能源化合物产量的运动发酵单胞菌、球形嗜酸菌和芳香新鞘氨醇菌的遗传工程工具综述

《Microbial Cell Factories》：Genetic tools for engineering Zymomonas mobilis, Cereibacter sphaeroides and Novosphingobium aromaticivorans to improve production of bioenergy compounds

　　本综述系统梳理了三种具有工业潜力的α-变形菌（运动发酵单胞菌、球形嗜酸菌和芳香新鞘氨醇菌）的遗传工具开发进展。文章重点探讨了如何利用CRISPR-Cas系统、转座子诱变、质粒载体等工具（如CRISPRi/dCas9、Tn7转座子、pIND4载体）对这些菌株进行代谢工程改造，以增强其利用独特代谢途径（如ED途径、MEP/MVA途径、木质素降解途径）生产生物能源化合物（乙醇、萜类等）的能力，为可持续生物燃料生产提供了重要技术路线图。

　　

遗传工具用于工程化运动发酵单胞菌、球形嗜酸菌和芳香新鞘氨醇菌以改善生物能源化合物生产

非模型细菌有限的遗传工具是遗传学研究的主要限制因素之一。本综述汇编了用于三种非模型α-变形菌的遗传工具，这些菌株因其独特的代谢途径和在极端环境中的韧性，在生产工业必需生物能源化合物方面具有巨大潜力。

引言

本综述重点介绍了为三种代谢多功能的α-变形菌开发的遗传工具和工程策略，重点关注它们在生物能源化合物生产方面的潜力。运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是一种模型乙醇生产菌，以其高乙醇产量而闻名。球形嗜酸菌（Cereibacter sphaeroides，原名Rhodobacter sphaeroides）在生物质分解、CO₂固定和萜类生产中发挥作用。芳香新鞘氨醇菌（Novosphingobium aromaticivorans）则以降解木质素和芳香化合物而著称。每种微生物都具有独特的遗传能力，当这些能力结合起来时，为生产多种可持续生物基化合物奠定了坚实基础。尽管这些物种具有强大的天然代谢能力，但它们需要遗传增强以扩展底物范围、提高产品产量和改善工业胁迫耐受性，这需要先进的遗传工具。它们密切的系统发育关系表明，为一种物种开发的遗传工具和工程策略可以经过最小程度的修改后转移到其他物种，从而加速菌株开发。

运动发酵单胞菌

运动发酵单胞菌表现出若干使其成为乙醇生产的优良宿主的特性。其特点包括高比葡萄糖摄取速率、高乙醇滴度和强大的乙醇耐受性，使其能够通过代谢工程从可再生底物（特别是木质纤维素水解物）合成生物乙醇。该菌株利用Entner-Doudoroff（ED）途径，该途径采用更少的酶促步骤，每摩尔葡萄糖产生一个ATP、一个NADH和两个丙酮酸分子。较低的ATP产量使得运动发酵单胞菌能量效率较低，这与其快速的葡萄糖摄取和乙醇生产速率有关。这有助于菌株将98%的底物碳转化为乙醇，在生物反应器中产生最少的生物质废物。

对运动发酵单胞菌进行了大量研究，重点开发遗传工具、代谢工程策略、生物产品生产以及基因组和转录组分析。这种细菌的小基因组（2.1 Mb），由一个环状染色体和四个质粒组成，使其比其他具有大基因组的物种更容易进行遗传修饰。通过表型芯片进行的代谢分析提供了详细的数据集，涉及葡萄糖、果糖以及各种氮、磷和硫源的利用，耐受酸性pH（低至4.0）并抵抗多种抑制剂，但对氯化物和亚硝酸盐敏感。基因组注释和表型芯片数据集进一步增强了对运动发酵单胞菌的遗传理解，使得能够系统研究生物燃料合成途径。因此，迄今为止已发布了几个代谢模型，包括用于通量平衡分析的中等水平化学计量模型、模拟体内和细胞游离提取物中糖酵解的动力学模型，以及六个基因组尺度代谢模型。这些模型突出了ED途径、丙酮酸脱羧酶和两种乙醇脱氢酶同工酶在从葡萄糖发酵生产乙醇和二氧化碳中的重要性。模型代谢控制分析表明，大部分通量控制主要存在于ATP消耗中。最近的两个运动发酵单胞菌模型，iZM4_478和iHN446，涉及各种基因、反应和代谢物。iHN446模型使用基因注释、文献、生理数据和生化数据库进行了完善。iZM4_478中的基因必要性预测主要基于单个混合转座子插入突变体的表型数据。这两个模型都基于通过随机转座子诱变产生的突变体表型。转座子诱变与高通量测序相结合，生成广泛的数据集，有助于评估不同环境条件下的突变体适应性，为完善运动发酵单胞菌的遗传和代谢模型提供宝贵见解。这些见解对于优化遗传修饰至关重要，包括整合外源途径以增强从农业废弃物生产生物能源。质粒开发的最新进展进一步促进了此类修饰，使运动发酵单胞菌菌株能够有效地将多种碳水化合物转化为有价值的生物燃料。

球形嗜酸菌

球形嗜酸菌是一种紫色非硫α-变形杆菌，属于红杆菌科。其基因组大小为4.5 Mb，特征明确，包括两个染色体（CI和CII）和五个额外的复制子。这种细菌具有生物合成工业相关化合物的潜力，例如基于萜类的生物能源化合物如没药烯、基于萜类的燃料、生物塑料等。萜类是通过其天然的MEP（2-甲基-d-赤藓糖醇-4-磷酸）途径合成的。也构建了带有异源生长解偶联MVA（甲羟戊酸）途径的菌株，将其代谢资源重新导向类异戊二烯合成，使这些菌株成为基于萜类的生物能源化合物前体分子类异戊二烯合成的有效底盘。这种细菌的一个显著特征是在厌氧条件下利用光能进行不放氧光合作用的能力。其将光能转化为化学能的能力、代谢多功能性以及利用各种有机化合物（如琥珀酸或苹果酸）作为电子供体而非水的能力，使其成为生物能源化合物生物合成的有吸引力的候选者。其代谢灵活性使其能够适应环境条件，如光照可用性、氧气和营养物质。

球形嗜酸菌在生产生物能源化合物方面具有巨大潜力，但充分利用这一点需要精确的代谢工程以优化途径通量。一个关键例子是卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）途径，该途径在将碳源转化为生物质和富含能量的化合物中起着关键作用。该途径受转录因子CbbR的调节。在球形嗜酸菌中，类似于相关物种如荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus），来自酶（如磷酸核酮糖激酶）的代谢信号影响CbbR活性，从而调节CBB循环的通量。微调这种调节可以增强碳同化并将代谢途径引导至生物能源生产。因此，理解和工程化这种调控是提高球形嗜酸菌生物能源产量的关键策略。

球形嗜酸菌已被广泛研究用于光异养、固氮和碳固定。其天然乙醇产量低于其他细菌物种，但与密切相关物种荚膜红细菌和莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的共培养研究已被证明可以提高乙醇产量。虽然球形嗜酸菌在厌氧条件下可以转变为发酵，产生基于萜类的生物能源化合物，但需要代谢工程来利用光能生产生物能源化合物，通过修饰酶和途径来优化氧化还原平衡并提高产量。参与光养、呼吸和许多其他代谢途径的代谢机制已被分析，但需要进一步改进。例如，球形嗜酸菌最突出和广泛使用的模型是2011年首次发布的基因组尺度代谢网络重建，称为iRsp1095。该模型包含1,095个基因、796种代谢物和1,158个反应，并具有球形嗜酸菌特异性的生物质反应。以及iRsp1140，它使用1,140个基因、878种代谢物和1,416个反应绘制球形嗜酸菌的代谢图。它提供了在有氧呼吸和厌氧光合作用期间吡啶核苷酸循环的见解，有助于生物燃料研究。

这些见解突出了球形嗜酸菌作为利用光能和帮助生物能源化合物生产的有前途的候选者。然而，该菌株需要进一步优化以实现生物能源化合物的高产量，例如通过微调基因表达以增强从关键途径（如碳水化合物代谢和卡尔文-本森-巴沙姆途径（CO₂固定）到MEP或MVA途径的通量。这个过程需要用于菌株改良的高效遗传工具，这在本综述中进行了讨论。

芳香新鞘氨醇菌

新鞘氨醇菌属（Novosphingobium）是一种杆状、革兰氏阴性α-变形杆菌，发现于深层陆地和水下沉积物中，以其代谢多功能性而闻名，特别是在降解芳香化合物、碳氢化合物（包括烷烃和芳香化合物如苯、甲苯、乙苯、二甲苯和多环芳烃）方面。此外，其木质素降解途径产生关键的代谢中间体，如琥珀酰辅酶A、乙酰辅酶A和香草酸。几种菌株，包括鱼腥新鞘氨醇菌（N. piscinae）、根际新鞘氨醇菌（N. rhizosphaerae）、太湖新鞘氨醇菌（N. taihuense）、地下新鞘氨醇菌（N. subterraneum）、芳香降解新鞘氨醇菌（N. aromaticivorans）和荚膜新鞘氨醇菌（N. capsulatum），以及最近发现的菌株如UCM-28T和E-II-3(T)，都对生物技术应用感兴趣。27个新鞘氨醇菌菌株的平均基因组大小为4.97 Mbp。这种细菌在生物燃料应用方面具有潜力，特别是在碳氢化合物生物降解和生物质转化方面。

它是一种特性明确的木质素降解细菌，以其能够分解代谢来自木质素的广泛芳香化合物而闻名。木质素生物转化是由专门的酶促成的，这些酶协调各种木质素衍生芳香化合物的分解和同化。这些酶包括氧化催化剂，如介导芳香环开裂的双加氧酶（例如LigAB），和特异性靶向β-O-4醚键的LigE。其他酶进行O-去甲基化和羟基化反应，使多种木质素衍生片段能够同化到中心代谢途径中，以及表1中总结的几个附加基因。这些酶的联合作用使新鞘氨醇菌能够有效地代谢和增值广泛的木质素衍生物，使其成为木质素生物转化和可持续生物产品合成的有前途的底盘。

该菌株采用一种独特的谷胱甘肽S-转移酶（Nu-class GST），它作为谷胱甘肽裂解酶，通过谷胱甘肽-β-羟基丙酰香草酮结合物（GS-HPV）的去谷胱甘肽化作用来切割β-芳基醚键（木质素中最丰富的连接）。实验进化和突变研究进一步揭示了负责氧化木质素衍生中间体（如愈创木基甘油-β-愈创木基醚（GGE））的酶，其中醛脱氢酶表达的改善有助于增强芳香分解代谢。像芳香降解新鞘氨醇菌MBES04这样的菌株的基因组研究也揭示了编码香草酸单加氧酶、原儿茶酸4,5-双加氧酶和儿茶酚降解途径的基因，支持其多功能的木质素增值潜力。

新鞘氨醇菌物种通过生物信息学预测具有通过EMP途径（KEGG途径-nar00010）合成乙醇的途径、通过磷酸戊糖途径（KEGG途径-nar_M00007）利用木糖的途径以及通过MEP途径（KEGG途径-nar00900）合成萜类化合物的途径。芳香降解新鞘氨醇菌被证明可通过纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶将复杂植物材料转化为可发酵糖，以及从芳香化合物合成类胡萝卜素。新鞘氨醇菌可能与其他微生物在复杂糖的降解和发酵中协同工作，以提高最终产物的产量。这种合作行为增强了整体降解效率，并支持可持续废物管理和生物质利用方法。

新鞘氨醇菌表现出显著的代谢灵活性，包括固氮和对pH波动、温度变化和有毒化合物的耐受性，使其对生物技术应用具有吸引力，如溢油修复。这些细菌利用像羟化酶和双加氧酶这样的酶将复杂碳氢化合物降解为更易生物降解的形式。它们的代谢潜力已通过像iNOVO479这样的模型进行了探索，该模型整合了479个基因、645个反应和604种代谢物，为研究芳香降解新鞘氨醇菌提供了一个基础框架。然而，需要进一步的实验数据来改进不同条件下生长、生物质产量和产物形成的模型预测。

生物信息学分析揭示了新鞘氨醇菌中推定木质素降解基因的存在，突出了它们在增值木质素衍生芳香化合物方面的潜在潜力。然而，该领域现在需要从计算机预测转向功能探索和这些遗传元件的合成重新利用。未来的研究应战略性地转向在易操作的底盘中进行利用和工程化这些途径，或通过基因组辅助的菌株改良，从而为生物精炼应用中的木质素增值开辟新途径。尽管前景广阔，这种细菌在可再生燃料合成方面大部分仍未探索。该菌株需要进行基因定制，以有效地用于生物能源化合物的生物合成。本综述中讨论的简便方法和工具将有助于新鞘氨醇菌的遗传学研究。

用于运动发酵单胞菌、球形嗜酸菌和新鞘氨醇菌的遗传工程工具的最新进展

遗传工程工具是用于直接修饰生物体遗传物质（DNA或RNA）的专门分子技术，能够精确地添加、移除或改变基因。这些工具是研究基因功能、增强性状以及开发用于生物技术、医学和农业各种应用的转基因生物（GMO）的基础。现代工具如CRISPR-Cas系统提供由RNA引导的高精度基因编辑，而像Tn7这样的转座子提供基因的稳定、位点特异性整合，使它们对代谢工程和合成生物学非常宝贵。尽管最近的研究拓宽了运动发酵单胞菌和球形嗜酸菌的遗传工具集，但用于向基因组传递遗传负荷和控制基因表达的简便工具和方法仍需扩展，特别是对于新鞘氨醇菌。基于在运动发酵单胞菌和球形嗜酸菌方面的工作经验，这里提到的一些因素需要扩展到新鞘氨醇菌或其他非模型细菌的工作中。

用于修饰的遗传可塑性菌株

工程化细菌菌株的一个重大挑战是限制修饰系统（RM）的存在，这些系统限制异源DNA。大多数细菌有一个或多个RM系统，通常通过甲基化模式的差异来区分外来DNA和天然序列。一种广泛使用的基因组修饰方法涉及使异源基因适应目标物种的天然甲基化谱，通常首先在限制缺陷型菌株中进行。一旦适应，这些基因被转移到参考或野生型菌株中进行进一步研究。在大肠杆菌中，限制缺陷型菌株如DH5α或DH10β被用作克隆宿主，而MG1655是遗传研究的参考菌株。此外，各种非甲基化大肠杆菌菌株被用于扩增载体，帮助它们在引入目标菌株时逃避宿主的限制修饰（RM）系统。

在运动发酵单胞菌ZM4中，已鉴定出多个RM系统。Rebase数据库列出了通过生物信息学和实验研究在运动发酵单胞菌、球形嗜酸菌和芳香降解新鞘氨醇菌的分离株中各种RM系统。在运动发酵单胞菌ZM4的RM系统中，最近的研究已经表征了一个I-F型CRISPR系统、两个I型RM系统和一个类似于mrr的M型系统。这些系统的限制缺陷型变体显示出与通过接合从大肠杆菌菌株转移的异源基因的改善兼容性。对这些系统及其DNA识别基序的洞察为创建下一代用于高效生物产品合成的运动发酵单胞菌菌株提供了宝贵指导。

类似地，球形嗜酸菌有多个RM系统来防御外来DNA。球形嗜酸菌菌株中已知的内切核酸酶，如RsaI（PvuI的异裂酶）、RshI（EcoRI的异裂酶）和RsrI，已在菌株如球形嗜酸菌2.4.1和球形嗜酸菌RS630中有文献记载。PacBio长读长甲基化组测序也揭示了球形嗜酸菌中的五种限制性内切核酸酶。此外，缺乏rshI基因的球形嗜酸菌突变体显示出改善的外源基因摄取能力。对非模型菌株如芳香降解新鞘氨醇菌中RM系统的全面分析对于推进这些生物的遗传工程至关重要。

菌株的重组工程能力

遗传重组在增强细菌菌株的遗传多样性方面起着关键作用，重组事件影响基因组稳定性、在DNA损伤胁迫下的存活、水平基因转移和进化适应。虽然重组频率和模式可能因复杂的遗传、环境和进化相互作用而在菌株间差异很大，但运动发酵单胞菌ZM4在几项研究中显示出强大的重组能力。通过单重组事件以0.3%的频率将不稳定载体成功整合到ZM4基因组中，证明了其功能性的重组机制，使运动发酵单胞菌ZM4高度适合遗传工程和生物技术应用。许多研究已经引入了外源重组酶，如recET、λ-red重组酶和FLP重组酶，表明有进一步探索它们对重组效率影响的空间。运动发酵单胞菌ZM4中影响天然重组系统的许多其他基因也已被研究。例如，himA基因产物在盐胁迫调节中的作用，xerCD和recA基因在DNA修复能力中的作用，以及重组过程。几篇论文解释了基于同源重组的基因组修饰，包括球形嗜酸菌和芳香降解新鞘氨醇菌中的水平基因转移，表明强大的重组潜力。recA基因在这两个物种中的存在进一步支持了它们在DNA修复和遗传交换中进行同源重组的潜力。球形嗜酸菌中的recA基因编码RecA重组酶，这是一种参与同源重组和DNA损伤（如紫外线暴露）后SOS反应的关键蛋白。球形嗜酸菌拥有一个具有两个染色体和多个质粒的复杂基因组，具有高度的基因重复（约30%），这支持了重组过程。recA的实验性删除（ΔrecA突变体）表明，虽然RecA对于有氧生长不是必需的，但它对于在DNA损伤条件下的存活至关重要。ΔrecA突变体在紫外线暴露后显示出显著降低的存活率，证实了RecA在DNA修复中的重要作用。新鞘氨醇菌的遗传重组是其代谢适应性的基础，由水平基因转移（HGT）、基因组重排和先进工程工具驱动。HGT使得能够获得关键的降解基因，如mlr簇，而质粒整合和基因重复增强了功能可塑性。调节元件如Rsh调节子和LuxR402通过群体感应和细胞包膜完整性影响基因组动力学和HGT潜力。这些特征共同支持新鞘氨醇菌在代谢工程中的重组能力，特别是在降解复杂污染物和优化木质素增值以用于可持续生物技术应用方面。

用于基因组工程的质粒载体

遗传工程经常使用载体将特定基因或DNA序列引入目标细胞，允许在基因添加或删除等应用中进行基因操作。许多质粒载体被设计用于细菌遗传学，包含基本元件如复制起点、动员元件、可选标记（例如抗生素抗性基因）和用于外源DNA插入的多克隆位点。一些用于运动发酵单胞菌、球形嗜酸菌和新鞘氨醇菌的载体列于表2。其中，广宿主范围质粒pRL814，源自pBBR，通常用于遗传工程，特别是与运动发酵单胞菌。该质粒包括用于选择的抗生素抗性标记、用于质粒维持的复制起点、用于接合的动员元件、lacI和IPTG诱导型启动子、GFP和多克隆位点。pRL814已被证明在运动发酵单胞菌中稳定。

另一个常用的质粒pIND4（异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导型表达质粒）通过IPTG诱导型启动子（PA1/04/03）实现球形嗜酸菌和运动发酵单胞菌中的异源基因表达，确保受控的蛋白质表达水平。最初为球形嗜酸菌开发，pIND4包括一个卡那霉素抗性盒、pMG160的稳定复制子、lacIq和几个用于在α-变形杆菌中高效使用的表达元件。pMG170是一种来自Blastobacter blasticus的大肠杆菌穿梭克隆载体。这种天然存在的质粒在红杆菌科的其他成员中稳定且有效复制。球形嗜酸菌维持18到23个pMG160拷贝，而大肠杆菌以高拷贝数保留它。诱导型启动子在球形嗜酸菌中表现出最小的泄漏，同时在大肠杆菌中实现高蛋白生产。它还包含一个动员元件，便于从大肠杆菌供体菌株S17-1 λpir转移到球形嗜酸菌。然而，将该质粒接合到运动发酵单胞菌和芳香降解新鞘氨醇菌中尚未建立。

已经开发了几种载体来感知副产物合成活动，如乙醇生产、环境线索和启动子强度分析。很少有研究广泛研究合成生物学工具，如转录生物传感器、合成启动子和高通量报告基因检测，以研究基因调控和蛋白质功能。虽然这些工作不直接关注微生物质粒工程，但从这些工作中发展的技术原理可以很容易地适应于设计和优化微生物宿主中基于质粒的基因表达系统。

荧光标记基因，如gfp和mCherry，已有效用于运动发酵单胞菌中的启动子强度分析，包括具有双报告系统的载体。此外，通过挖掘芳香降解新鞘氨醇菌DSM 12444的基因组，创建了一种新型二苯乙烯响应生物传感器。该生物传感器可以区分白藜芦醇与其前体，并检测具有间苯二酚基团的其他二苯乙烯和具有β-雷琐酸官能团的次大麻二酚酸。它还可以感知细胞内白藜芦醇生产的变化，可能促进微生物细胞工厂的代谢工程以生产二苯乙烯和大麻素。

用于基于重组的遗传工程的质粒载体

已经开发了几种用于基因失活的方法，使用基于宿主的重组或异源λ重组酶介导的重组，将抗生素抗性基因整合到自杀质粒或线性DNA片段中，如运动发酵单胞菌中所证明的。质粒消除一直是这种基因组修饰的关键问题，其中需要“不稳定”或“自杀”载体以在无标记基因组修饰后帮助消除质粒。

最近，一种基于同源重组的技术被引入用于运动发酵单胞菌中的无标记基因组修饰。这种两步法最初通过同源重组将工程化的自杀质粒（pPK15534）整合到基因组中，该质粒含有运动发酵单胞菌靶向序列。该质粒配备GFP作为荧光标记，有两个500 bp的同源区域，促进两个重组事件。在第一个事件中，质粒被整合到基因组中。而在第二个事件中，它被切除，导致在特定比例下产生修饰的或野生型的基因组。然后通过PCR扩增区分野生型和缺失突变体基因型。该系统允许有效的基因添加或删除，而无需在运动发酵单胞菌基因组的所需位置引入抗生素抗性基因，使其成为适用于其他α-变形杆菌的遗传工程的通用平台。该策略的一个关键特征是，从自杀质粒表达的GFP允许使用荧光激活细胞分选仪轻松识别已丢失质粒的细胞。该技术高效、适应性强，适用于其他非模型细菌。基于sacB的反向选择标记也已被证明对质粒消除有效。这种方法使得应用可行，无需昂贵的荧光辅助细胞分选仪，但运动发酵单胞菌ZM4也被注释含有sacB，质疑了该方法对运动发酵单胞菌的普遍实用性。

用于基因组修饰的基于转座子的工具

转座子诱变已广泛用于细菌中以探索基因功能、遗传途径和基因组组织。这种方法可以产生极性突变，导致营养缺陷型和抗生素敏感突变体。转座子Tn5、Tn7和Tn10通常用于细菌遗传学。虽然Tn5和Tn10随机插入整个基因组，但Tn7在特定的附着位点整合。高通量核酸测序的最新进展显著提高了我们分析这些转座子诱导的随机诱变结果的能力。Tn5转座子诱变与高通量测序（Tn-Seq或TraDIS）相结合，为遗传学研究提供了一个强大的工具，用于识别必需基因和理解它们在生物体基因组中的功能。与通常依赖靶向基因删除的经典遗传学不同，Tn-Seq利用随机转座子插入，通常每个基因组单拷贝。在需要那些基因生长或适应性的条件下，插入必需基因的菌株预计会失去活力。通过评估特定生长条件下转座子插入频率在基因组中的分布，Tn-Seq有助于功能性基因组分析。该方法已应用于识别必需基因并评估它们在生长和适应性中的作用，在球形嗜酸菌和运动发酵单胞菌中。一种相关的方法，CRISPR干扰（CRISPRi），也已开发用于类似的功能研究。