综述：利用CRISPR-Cas9系统编辑优良番茄品系的关键问题

《Euphytica》：Key issues in editing elite-tomato lines by CRISPR-Cas9 system

　　本综述系统阐述了CRISPR-Cas9技术在优良番茄（Solanum lycopersicum）育种中的应用框架。文章详细解析了靶点选择（结合转录组学、文献与多组学分析）、gRNA设计（避免脱靶效应）、载体构建（如Golden Braid系统）及递送方法（农杆菌/病毒介导等）等关键环节，并探讨了突变体筛选与无Cas9后代获得策略。该技术通过精准编辑（如SIAGL6、SIPMR4等基因）可显著提升番茄抗逆性（TYLCV、白粉病等）与果实品质，虽面临脱靶、嵌合体等挑战，但结合人工智能与纳米技术等前沿手段，有望推动可持续农业发展。

　　

靶点选择：多组学联动的精准设计

优良番茄品种的CRISPR-Cas9编辑首要步骤是靶点筛选。研究者需整合转录组学分析（如差异表达基因DEGs鉴定）、qRT-PCR验证与文献挖掘，避免因基因功能冗余或发育相关性引发不良连锁反应。例如，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别胁迫响应模块，结合突变体库与QTL定位数据，可优先选择SlHyPRP1（耐盐性）、SIDMR6-1（广谱抗病性）等已证实编辑后无显著多效性影响的靶点（表1）。多组学整合（如蛋白质组、代谢组）进一步弥补转录后调控的盲区，提升靶点可靠性。

gRNA设计：平衡效率与特异性

gRNA的优化设计是减少脱靶（off-target）的关键。标准SpCas9的gRNA长度通常为20 nt，需紧邻PAM序列（NGG），且GC含量以50%-65%为宜。种子区域（近PAM端8-10 nt）的可及性、避免SNP位点及二级结构干扰是核心原则。工具软件（如CRISPOR、CRISPR-P 2.0）可预测效率评分与脱靶位点，但需实验验证（如T7E1酶切、高通量测序HTS）确认（表2）。例如，SlSOS1基因编辑中，gRNA的G²⁰定位与避免C³可增强切割效率。

载体构建：模块化工具加速组装

CRISPR-Cas9组件组装依赖Golden Gate、Golden Braid（GB）等模块化系统。GB4.0平台通过分级反应实现多转录单元（TU）的“一锅法”组装，兼容gRNA表达盒（如AtU6启动子）与Cas9（35S或NOS启动子）的定向连接（图2）。载体设计需注意gRNA支架的强终止信号，防止RNA聚合酶II通读。大肠杆菌菌株（DH5α、TOP10）因其高转化效率与低重组率，常用于质粒扩增。

递送方法：从稳定转化到病毒介导

农杆菌介导的稳定转化仍是主流，但受基因型再生能力限制。优化菌株（如添加乙酰丁香酮）与花蕾浸染法可提升顽固品种效率（图3）。病毒诱导基因组编辑（VIGE）则通过gRNA的病毒载体（如双生病毒）实现体细胞编辑，避免DNA整合，但HDR效率待提升（图4）。新兴技术如核糖核蛋白（RNPs）递送与纳米载体提供无DNA编辑可能。

筛选与安全：精准追踪与转基因消除

突变体筛选依赖抗生素（nptII、hptII）或荧光标记（GFP、DsRed）。Sanger测序与表型分析验证编辑效果后，通过T₀代回交获得无Cas9的T₁代，满足商业化安全需求。跨代基因编辑（TGE）技术可稳定遗传突变（如SlSP5G调控开花时间），加速育种进程。

挑战与展望：技术融合推动育种革命

CRISPR-Cas9技术在番茄育种中仍面临基因型依赖性、脱靶风险及监管壁垒。未来结合人工智能（优化gRNA设计）、纳米递送（提升效率）与多组学整合，将精准塑造抗逆、优质新品种，为气候智能型农业提供解决方案。