熊果酸通过调节睾丸管周肌样细胞中的铁死亡（Ferroptosis）来缓解附睾炎

《Animal Research and One Health》：Ursolic Acid Alleviates Orchitis via Modulating Ferroptosis in Peritubular Myoid Cells of Testis

　　中国林麝慢性应激诱导睾丸炎症中乌索酸抑制铁依赖性细胞死亡的研究。通过体外模型，证实乌索酸通过调节铁代谢、减少脂质过氧化和增强抗氧化酶活性，抑制TNF-α诱导的炎症及铁依赖性细胞死亡，为鹿沼母鹿繁殖保护提供新策略。

　　慢性压力对生殖健康产生显著的负面影响，可能增加诸如睾丸炎等病理状态的易感性。此外，维持铁稳态对于保持睾丸功能至关重要，而铁过载会导致脂质过氧化和铁积累，从而引发睾丸细胞的铁死亡。乌索酸（UA）是一种天然存在于多种植物中的五环三萜类化合物，具有治疗炎症和慢性退行性疾病的潜力。然而，UA在睾丸炎和铁死亡中的作用机制尚不明确。本研究旨在探讨UA对睾丸炎症中铁死亡的影响。通过组织病理学分析，发现慢性压力导致的意外死亡的成年森林麝鹿（FMD）睾丸组织中存在炎症浸润。在体外实验中，UA能够有效减轻肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的炎症。同时，UA通过调控过量脂质过氧化的分解、增强抗氧化酶的活性以及激活细胞内的铁代谢，抑制了铁死亡的发生。这些结果表明，UA可能具有多靶点、多通路的治疗作用，有助于维持生殖稳态。这些发现提示UA可能成为预防慢性压力诱导疾病的潜在功能成分。

铁在男性生殖功能的调节中发挥着重要作用，且对睾丸组织具有双重效应。然而，当铁在睾丸中过量积累时，可能导致氧化应激、脂质过氧化和铁死亡。铁死亡是一种非凋亡性的细胞死亡形式，依赖于铁，并通常以显著的铁积累和脂质过氧化为特征。铁死亡的关键机制涉及细胞膜中不饱和脂肪酸的过氧化反应，由亚铁离子或脂氧合酶的催化作用引起，最终导致细胞死亡。此外，铁死亡还与抗氧化谷胱甘肽系统中的关键调节酶水平下降相关。研究表明，铁过载可能诱发炎症，而抑制铁死亡则有助于缓解炎症过程。因此，针对睾丸铁死亡可能成为治疗睾丸炎的新策略。

乌索酸（UA）是一种天然的抗炎成分，已被证实对多种炎症和慢性疾病具有保护作用。以往的研究已广泛探讨了UA的抗炎机制，包括减少肥大细胞释放组胺、抑制脂氧合酶、环氧合酶和磷脂酶的活性，以及降低一氧化氮和活性氧（ROS）的生成。此外，UA还能够下调炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，并抑制弹性蛋白酶和补体的活性。尽管已有诸多进展，但其在睾丸炎发展中的具体作用机制仍不完全明确。特别是，虽然UA已被证明对铁死亡具有保护作用，但其是否通过调控铁死亡来减轻睾丸间质细胞（TPCs）中TNF-α诱导的炎症仍需进一步研究。本研究中，我们调查了在人工饲养条件下成年FMD的睾丸炎，并建立了一种TNF-α诱导的TPCs炎症模型，以研究UA的作用及其潜在机制。结果表明，UA具有减轻炎症和铁死亡的潜力，从而缓解人工饲养条件下FMD的慢性压力，降低睾丸炎的发生。值得注意的是，睾丸炎不仅存在于FMD中，也在其他哺乳动物中普遍存在，其发病机制和病理过程相似。因此，UA对FMD睾丸炎的抑制作用可能为其他人工饲养动物的睾丸炎预防和治疗提供新的思路。

为了研究UA对睾丸炎的干预作用，本研究首先采集了六只意外死亡的FMD睾丸组织，并对其中的组织学特征进行了分析。通过苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学（IHC）分析，观察到成年FMD睾丸组织中存在明显的炎症细胞浸润，而幼年FMD睾丸组织中则未见显著变化。此外，研究还发现，成年FMD睾丸组织中炎症细胞因子的表达水平显著高于幼年个体。为了进一步研究炎症的分子机制，我们通过RNA测序和差异表达基因（DEGs）的分析，发现炎症相关基因主要富集于核因子（NF）-κB信号通路、TNF信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。这些发现支持了慢性压力与睾丸炎症之间的关联，并提示了其可能的分子机制。

在体外实验中，我们培养了FMD的TPCs，并通过不同浓度的TNF-α诱导炎症模型。结果表明，TNF-α在一定程度上影响了细胞的活性，但其对细胞存活的影响并不显著。进一步的实验发现，TNF-α能够显著增加细胞内的ROS水平，并且这种变化与脂质过氧化和铁死亡密切相关。通过Western blot和免疫荧光分析，我们观察到在TNF-α刺激下，与铁死亡相关的GPX4、ACSL4和COX2蛋白表达水平明显升高，而GPX4的mRNA表达则未见显著变化，这可能与GPX4蛋白的表达调控有关。这些结果表明，TNF-α诱导的炎症过程可能通过铁死亡机制导致细胞损伤。为了验证这一假设，我们使用了特异性铁死亡抑制剂Fer-1，发现其能够部分缓解TNF-α引起的细胞损伤，并抑制与铁死亡相关的改变。这些结果进一步支持了铁死亡在TNF-α诱导的炎症过程中的核心作用。

考虑到当前睾丸炎的临床治疗手段有限，研究者们将注意力转向天然产物，以寻找更有效的治疗策略。UA作为一种天然的生物活性化合物，具有广泛的生物学特性。虽然已有研究表明UA对少精症具有保护作用，但其在睾丸炎中的治疗潜力仍需进一步验证。本研究中，我们发现UA能够有效减轻TNF-α诱导的TPCs炎症反应，并通过调节脂质过氧化、抗氧化酶活性和铁稳态来抑制铁死亡的发生。这表明UA的抗炎作用可能与其对铁死亡的抑制密切相关。实验结果支持了这一假设，即UA通过直接调控铁代谢相关蛋白的表达，减少细胞内的铁积累，同时增强抗氧化防御，从而打破“铁死亡-氧化应激-炎症”之间的恶性循环。具体而言，UA能够减少Fe2?的积累，提高GPX4蛋白的表达，增强SOD活性，并调节GSH-GSSG的比例，从而显著降低ROS水平。这些效应有助于抑制膜脂质过氧化，减少炎症反应的加剧。此外，分子对接分析表明，UA与铁死亡相关蛋白如FTL和COX2具有较强的结合能力，这进一步支持了其对铁死亡和炎症通路的调控作用。

除了上述机制，铁代谢的调控在铁死亡过程中也发挥着重要作用。细胞内的铁水平通过吸收、储存和释放等过程进行严格调控。Fe2?主要通过转铁蛋白/转铁蛋白受体1（TF/TFR-1）转运系统和SLC39A14通道进行摄取。这些转运蛋白的过度表达或异常激活可能导致细胞内Fe2?的过量积累，从而诱发铁死亡。在本研究中，我们发现TNF-α刺激能够显著增加SLC39A14的表达，进而促进Fe2?的内流。然而，UA的预处理能够抑制这种Fe2?的过量摄入，并通过上调FTH1和Ftl的表达，促进细胞内稳定铁蛋白的合成，从而减少游离铁的积累。此外，SLC40A1负责将Fe2?从细胞内转运至细胞外，以维持系统的铁稳态。而SLC7A11是谷氨酸-半胱氨酸逆向转运蛋白的重要组成部分，其活性下降可能影响脂质过氧化的清除。UA预处理能够显著上调SLC7A11的表达，这提示UA不仅能够抑制铁的过度积累，还能够促进稳定铁蛋白的合成，从而发挥抗铁死亡的作用。

综上所述，本研究揭示了慢性压力对FMD睾丸组织的负面影响，特别是在引发炎症和铁死亡方面的关键作用。通过建立体外炎症模型，我们发现UA能够有效减轻TNF-α诱导的炎症反应，并通过调节铁代谢和抗氧化能力来抑制铁死亡的发生。这些结果表明，UA在慢性压力相关的睾丸炎中可能具有多靶点、多通路的治疗潜力。此外，UA对铁死亡和炎症的调控作用，可能为其他人工饲养动物的睾丸炎防治提供新的思路。未来的研究应进一步探索UA的分子机制，并评估其在其他哺乳动物中的应用前景。